Authors:	Pannenbeckers, Marc
Advisor:	Wölfel, Thomas
Title:	Nachweis von HLA-unabhängigen tumorreaktiven T-Zellen in Nabelschnurblut
Online publication date:	24-Nov-2022
Year of first publication:	2022
Language:	german
Abstract:	Im Blut der Melanompatientin Ma-Mel-86 mit HLA Klasse I-negativen Metastasen wurde im Krankheitsverlauf das Auftreten einer HLA-unabhängigen antitumoralen T-Zellreaktion beobachtet, die durch CD8-positive zytotoxische 𝛼:𝛽-T-Zellen vermittelt war. Zwei Zielantigene dieser T-Zellen wurden bislang identifiziert, nämlich CSF2RA (engl. für colony stimulating factor 2 receptor subunit alpha) und TRP2 (engl. für tyrosinase related protein 2). Diese Antigene werden von den jeweiligen T-Zellrezeptoren auf der Zelloberfläche erkannt. In der vorliegenden Arbeit sollte herausgefunden werden, ob sich HLA- unabhängige T-Zellen gegen die oben genannten bekannten und gegen unbekannte Tumor-assoziierte Antigene in Nabelschnurblut (UCB, engl. für umbilical cord blood) nachweisen lassen. Dafür sollten UCB-Lymphozyten mit HLA-negativen Tumorzellen stimuliert und expandiert werden. Bereits im Vorfeld war dafür in der Zelllinie Ma-Mel-86B, welche aufgrund einer spontanen biallelischen B2M-Geneletion kein HLA Klasse I auf der Oberfläche trägt, durch einen TALEN-vermittelten Knockout des Gens CIITA die Expression von HLA Klasse II-Molekülen ausgeschaltet worden. Zur Verbesserung der Stimulationseigen- schaften sollten nunmehr diese HLA Klasse I/II-negativen Zellen mit den kostimulatorischen Molekülen CD80 und CD83 ausgestattet werden. Dafür wurde im ersten Schritt ein für CD80 und CD83 kodierendes, funktionale bicistronisches Konstrukt im retroviralen Vektor pMX hergestellt, in dem die Gene für die beiden Proteine durch eine für das virale Strukturmotiv P2A kodierende Gensequenz getrennt waren, um eine möglichst äquimolare Expression beider Moleküle zu erreichen. HLA Klasse I/II-negative Ma-Mel-86B-Zellen wurden mit dem Konstrukt retroviral transduziert, die daraufhin beide kostimulatori- schen Moleküle hoch und stabil exprimierten und für die Stimulation von UCB-Lymphozyten eingesetzt wurden. Aus Nabelschnurblut wurden CD3-positive T-Zellen isoliert und in Minikulturen zu je 5⋅10e4 Zellen mit den vorbereiteten HLA-negativen Melanomzellen stimuliert. Die Responderlymphozyten der Minikulturen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten hinsichtlich der Erkennung HLA Klasse I/II-negativer Melanomzellen, HLA Klasse I/II-negativer HEK293T-Zellen, die TRP2 bzw. CSF2RA nach Transfektion überexprimierten, und K562-Zellen getestet. Gefunden wurden Minikulturen, die nur HLA-negative Mela- nomzellen, aber nicht Antigen-Transfektanten und nicht K562 als Zielzelle natürlicher Killlerzellen, sowie Minikulturen, die neben HLA-negativen Melanomzellen auch TRP2-Transfektanten, jedoch nicht K562, erkannten. Erstere wurden als reaktiv gegen unbekannte Antigene auf der Oberfläche von Melanomzellen, letztere als TRP2-spezifisch gewertet. Sicher gegen CSF2RA gerichtete T-Zellen wurden nicht iden- tifiziert. Die geschätzten Frequenzen HLA-unabhängiger T-Zellen in CD3-positiven UCB-Lymphozyten lagen bei ≈5 0⋅10e−6 für T-Zellen gegen Melanom-assoziierte Antigene und bei ≈7,7⋅10e−7 für T-Zellen gegen TRP2. Somit wurde mit Hilfe HLA Klasse I/II-negativer Tumorzellen das Vorhandensein von HLA-unabhängigen T-Zellen gegen TRP2 und andere Zielantigene in Nabelschnurblut nachgewie- sen. Nabelschnurblut kann deshalb als Quelle für HLA-unabhängige, Tumor-reaktive T-Zellen und deren Rezeptoren dienen. Ihre therapeutische Anwendung würde es ermöglichen, den Verlust von HLA als ei- nen wesentlichen Mechanismus der Immunevasion von Tumoren zu umgehen. Zudem würde der Einsatz HLA-unabhängiger T-Zelleffektoren breite Anwendungsoptionen versprechen.
DDC:	610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-8266
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-0803fb20-b65b-4717-b0f4-ef72937e05511
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	viii, 81 Seiten ; Illustrationen, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen