Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-4764
Authors: Bogus, Magdalena
Title: Multiplex-Genotypisierung forensisch relevanter SNPs unter Verwendung von Microarrays auf chemisch aktivierten Glasflächen
Online publication date: 29-Mar-2011
Year of first publication: 2011
Language: german
Abstract: Die Analyse tandem-repetitiver DNA-Sequenzen hat einen festen Platz als genetisches Typisierungsverfahren in den Breichen der stammesgeschichtlichen Untersuchung, der Verwandtschaftsanalyse und vor allem in der forensischen Spurenkunde, bei der es durch den Einsatz der Multiplex-PCR-Analyse von Short Tandem Repeat-Systemen (STR) zu einem Durchbruch bei der Aufklärung und sicheren Zuordnung von biologischen Tatortspuren kam. Bei der Sequenzierung des humanen Genoms liegt ein besonderes Augenmerk auf den genetisch polymorphen Sequenzvariationen im Genom, den SNPs (single nucleotide polymorphisms). Zwei ihrer Eigenschaften – das häufige Vorkommen innerhalb des humanen Genoms und ihre vergleichbar geringe Mutationsrate – machen sie zu besonders gut geeigneten Werkzeugen sowohl für die Forensik als auch für die Populationsgenetik.\r\nZum Ziel des EU-Projekts „SNPforID“, aus welchem die vorliegende Arbeit entstanden ist, wurde die Etablierung neuer Methoden zur validen Typisierung von SNPs in Multiplexverfahren erklärt. Die Berücksichtigung der Sensitivität bei der Untersuchung von Spuren sowie die statistische Aussagekraft in der forensischen Analyse standen dabei im Vordergrund. Hierfür wurden 52 autosomale SNPs ausgewählt und auf ihre maximale Individualisierungsstärke hin untersucht. Die Untersuchungen der ersten 23 selektierten Marker stellen den ersten Teil der vorliegenden Arbeit dar. Sie umfassen die Etablierung des Multiplexverfahrens und der SNaPshot™-Typisierungsmethode sowie ihre statistische Auswertung. Die Ergebnisse dieser Untersuchung sind ein Teil der darauf folgenden, in enger Zusammenarbeit der Partnerlaboratorien durchgeführten Studie der 52-SNP-Multiplexmethode. \r\nEbenfalls im Rahmen des Projekts und als Hauptziel der Dissertation erfolgten Etablierung und Evaluierung des auf der Microarray-Technologie basierenden Verfahrens der Einzelbasenverlängerung auf Glasobjektträgern. Ausgehend von einer begrenzten DNA-Menge wurde hierbei die Möglichkeit der simultanen Hybridisierung einer möglichst hohen Anzahl von SNP-Systemen untersucht. Die Auswahl der hierbei eingesetzten SNP-Marker erfolgte auf der Basis der Vorarbeiten, die für die Etablierung des 52-SNP-Multiplexes erfolgreich durchgeführt worden waren. \r\nAus einer Vielzahl von Methoden zur Genotypisierung von biallelischen Markern hebt sich das Assay in seiner Parallelität und der Einfachheit des experimentellen Ansatzes durch eine erhebliche Zeit- und Kostenersparnis ab. In der vorliegenden Arbeit wurde das „array of arrays“-Prinzip eingesetzt, um zur gleichen Zeit unter einheitlichen Versuchsbedingungen zwölf DNA-Proben auf einem Glasobjektträger zu typisieren. Auf der Basis von insgesamt 1419 typisierten Allelen von 33 Markern konnte die Validierung mit einem Typisierungserfolg von 86,75% abgeschlossen werden. Dabei wurden zusätzlich eine Reihe von Randbedingungen in Bezug auf das Sonden- und Primerdesign, die Hybridisierungsbedingungen sowie physikalische Parameter der laserinduzierten Fluoreszenzmessung der Signale ausgetestet und optimiert. \r\n
The analysis of tandem-repetitive DNA sequences is well established as a genetic typing procedure in research fields such as molecular anthropology, kinship analysis and especially in the forensic case work. The introduction of multiplex PCR typing methods of short tandem repeat systems (STR) led to a breakthrough in forensic analysis by facilitating the fast and reliable identification of biological stains from a crime scene. During the human genome project special attention was always given to genetically polymorphic sequence variations in the genome, the SNPs (single nucleotide polymorphisms). Two of their properties - the frequent occurrence within the human genome and their comparatively low mutation rate - make them particularly well suited both for forensic applications as well as for population genetics. \r\nThe purpose of the \"SNPforID\" EU project, from which this work emerged, was declared in establishing new valid multiplex assays for SNP typing for forensic purposes. In this context, criteria such as the sensitivity in stain analysis as well as the statistical power were particularly important. 52 autosomal SNPs were selected for this purpose and investigated regarding their maximal power of individualisation. Examinations of the initially selected 23 selected markers constitute the first part of the current work. They include the implementation of the multiplex PCR and the Snapshot ™ typing methods as well as the statistical analysis. The results of this study are part of the subsequent research on the 52-SNP-multiplex method carried out in close cooperation between the partner laboratories from the SNPforID project. \r\nThe implementation and evaluation of the microarray technology of single-base extension method on glass slides was also performed within the framework of the project and as the main objective of this thesis. Based on the condition of a limited availability of stain DNA the feasibility of simultaneous hybridization of as many SNPs as possible has been tested. The selection of SNP markers used for this approach was made from the 52-SNP multiplex assay which had been established successfully by that time. \r\nFrom a variety of methods for genotyping biallelic markers, this assay is characterized by its parallel typing approach and the simplicity of the experimental design resulting in a significant time and cost saving. In the present work, the \"array of arrays\" principle was adopted for the simultaneous typing of twelve DNA samples on each glass slide under identical experimental conditions. Based on a total number of 1419 alleles from 33 successfully typed SNP markers the validation could be completed with an overall typing success of 86.75%. At the same time a number of basic conditions with reference to the probe and primer design, the hybridization conditions and physical parameters of the laser-induced fluorescence measurement of the signals were tested and optimized.\r\n
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-4764
URN: urn:nbn:de:hebis:77-27416
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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