Reinigung des C4-Dicarboxylat-Transporters DctA und dessen regulatorischer Einfluss auf die Aktivität der Sensorkinase DcuS
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Das Bakterium Escherichia coli detektiert C4-Dicarboxylate über das Zweikomponentensystem
DcuSR, welches die Expression der zugehörigen Stoffwechselwege kontrolliert. Durch die
Interaktion mit den Transportern DctA (aerob) und DcuB (anaerob) wird die Sensorkinase
DcuS in die für C4-Dicarboxylate responsive Form überführt. Sind die Transporter deletiert,
wird die Expression DcuS-regulierter Gene dauerhaft angeschaltet und die Aktivität
von DcuS kann in dcuB-lacZ-Expressionsstudien durch Fumarat nicht weiter gesteigert
werden. In dieser Arbeit wurde die Grundlage für ein definiertes System geschaffen, in
dem die Phosphorylierung von DcuS in Abhängigkeit von DctA und Fumarat untersucht
werden kann. DctA wurde mit eCFP (enhanced cyan fluorescent protein) fusioniert und
die Löslichkeit des Transporters gesteigert. Das His6-eCFP-L-DctA-Konstrukt war im
Transport funktional und regulatorisch aktiv. Die Überproduktion und Isolierung von
DctA wurde optimiert. Unter Verwendung des Detergenz Fos-Cholin-12 zur Extraktion
des Proteins aus der Membran wurde die beste Reinheit und Ausbeute erreicht. Das Isolat
war zu 95 % rein und enthielt ca. 50 % Protein, dessen Mobilität im SDS-Gel der für aktives
(nicht denaturiertes) DctA typischen entsprach. DcuS und DctA wurden in extrahierten
E. coli Membranen ko-rekonstituiert und die Phosphorylierung von DcuS gemessen. DctA
war in ersten Versuchen in der Lage die maximale Phosphorylierung von DcuS mit und
ohne Fumarat zu reduzieren und die Dephosphorylierung der Sensorkinase zu verzögern.
Darüber hinaus wurde die Substratspezifität von DcuS-Varianten untersucht, in denen
für die Substratbindung essentielle Aminosäuren ausgetauscht worden waren. Ergänzend
dazu wurde die unter energetischen Gesichtspunkten wahrscheinlichste Positionierung
der Effektoren in DcuS-PASP mit Molekularem Docking berechnet. DcuS stellte sich als
für L-Malat optimiert heraus, und wird aufgrund der Konfiguration der Substituenten
gegenüber anderen C4-Dicarboxylaten bevorzugt. Die Konfiguration von L-Malat
ermöglicht die energetisch optimale Positionierung eines C4-Dicarboxylats innerhalb
von DcuS-PASP. Andere C4-Dicarboxylate werden ähnlich wie L-Malat koordiniert.