Reinigung des C4-Dicarboxylat-Transporters DctA und dessen regulatorischer Einfluss auf die Aktivität der Sensorkinase DcuS

Abstract

Das Bakterium Escherichia coli detektiert C4-Dicarboxylate über das Zweikomponentensystem DcuSR, welches die Expression der zugehörigen Stoffwechselwege kontrolliert. Durch die Interaktion mit den Transportern DctA (aerob) und DcuB (anaerob) wird die Sensorkinase DcuS in die für C4-Dicarboxylate responsive Form überführt. Sind die Transporter deletiert, wird die Expression DcuS-regulierter Gene dauerhaft angeschaltet und die Aktivität von DcuS kann in dcuB-lacZ-Expressionsstudien durch Fumarat nicht weiter gesteigert werden. In dieser Arbeit wurde die Grundlage für ein definiertes System geschaffen, in dem die Phosphorylierung von DcuS in Abhängigkeit von DctA und Fumarat untersucht werden kann. DctA wurde mit eCFP (enhanced cyan fluorescent protein) fusioniert und die Löslichkeit des Transporters gesteigert. Das His6-eCFP-L-DctA-Konstrukt war im Transport funktional und regulatorisch aktiv. Die Überproduktion und Isolierung von DctA wurde optimiert. Unter Verwendung des Detergenz Fos-Cholin-12 zur Extraktion des Proteins aus der Membran wurde die beste Reinheit und Ausbeute erreicht. Das Isolat war zu 95 % rein und enthielt ca. 50 % Protein, dessen Mobilität im SDS-Gel der für aktives (nicht denaturiertes) DctA typischen entsprach. DcuS und DctA wurden in extrahierten E. coli Membranen ko-rekonstituiert und die Phosphorylierung von DcuS gemessen. DctA war in ersten Versuchen in der Lage die maximale Phosphorylierung von DcuS mit und ohne Fumarat zu reduzieren und die Dephosphorylierung der Sensorkinase zu verzögern. Darüber hinaus wurde die Substratspezifität von DcuS-Varianten untersucht, in denen für die Substratbindung essentielle Aminosäuren ausgetauscht worden waren. Ergänzend dazu wurde die unter energetischen Gesichtspunkten wahrscheinlichste Positionierung der Effektoren in DcuS-PASP mit Molekularem Docking berechnet. DcuS stellte sich als für L-Malat optimiert heraus, und wird aufgrund der Konfiguration der Substituenten gegenüber anderen C4-Dicarboxylaten bevorzugt. Die Konfiguration von L-Malat ermöglicht die energetisch optimale Positionierung eines C4-Dicarboxylats innerhalb von DcuS-PASP. Andere C4-Dicarboxylate werden ähnlich wie L-Malat koordiniert.