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Authors: Beck, Christian
Title: Untersuchung multimerer Proteinkomplexe mit oberflächenanalytischen und röntgenspektroskopischen Methoden
Online publication date: 28-Nov-2011
Language: german
Abstract: Zusammenfassung rnrnIn dieser Arbeit wurden Untersuchungen an zwei verschiedenen multimeren Proteinkomplexen durchgeführt: Zum einen am Hämocyanin aus Homarus americanus mittels Röntgen-L-Kantenspektroskopie und zum anderen am α-Toxin aus Staphylococcus aureus, hinsichtlich der Interaktion an speziellen Raft-artigen Membranabschnitten, mittels AFM.rnFür das Hämocyanin aus Homarus americanus konnte ein neuer Aspekt bezüglich der Bindung von Sauerstoff aufgezeigt werden. Ein zuvor nicht in Betracht gezogener und diskutierter Einfluss von Wassermolekülen auf diesen Vorgang konnte mittels der Methode der Röntgen-L-Kantenspektroskopie dargestellt werden. Erstmals war es möglich die beiden verschiedenen Beladungszustände (Oxy-, Deoxy-Zustand) des Hämocyanin mittels dieser Methode in physiologisch ähnlicher Umgebung zu untersuchen. Vergleiche der erhaltenen L-Kanten-Spektren mit denen anorganischer Vergleichslösungen ließen auf eine Interaktion von Wassermolekülen mit den beiden Kupferatomen des aktiven Zentrums schließen. Dadurch wurde erstmals ein möglicher Einfluss des Wassers auf den Oxygenierungsprozess des Hämocyanins auf elektronischer Ebene aufgezeigt. Vergleichende Betrachtungen von Röntgenkristallstrukturen verschiedener Typ-3-Kupferproteine bestätigten, dass auch hier ein Einfluss von Wassermolekülen auf die aktiven Zentren möglich ist. Vorgeschlagen wird dabei, dass an Stelle der Überlappung der 3d-Orbitale des Kupfers mit den 2p-Orbitalen des Sauerstoffs, wie sie im sauerstoffbeladenen Zustand auftritt, im sauerstoffunbeladenen Zustand eine Wechselwirkung der 3d-Orbitale des Kupfers mit den LUMOS der Wassermoleküle möglich wird, und ein Elektronen- bzw. Ladungstransfer von den Kupfern auf die Wassermoleküle erfolgen kann. rnAFM-Untersuchungen hinsichtlich der Interaktion des α-Toxins aus Staphylococcus aureus mit oberflächenunterstützten Modellmembranen wiesen darauf hin, dass eine bevorzugte Anbindung und zumindest teilweise Integration der α-Toxine in Raft-artige Membranbereiche stattfindet. Für verschiedene ternäre Lipidsysteme konnten phasenseparierte Modellmembranen abgebildet und die unterschiedlichen Domänenformen zugeordnet werden. Der Anbindungsprozess der Toxine an diese oberflächenunterstützte Modellmembranen erfolgte dann wahrscheinlich vornehmlich an den speziellen Raft-artigen Domänen, wohingegen die Insertion der Poren vorrangig an den Grenzbereichen zwischen den Domänen auftrat. Mögliche Ursache dafür sind die räumlichen Besonderheiten dieser Grenzflächen. Membranen weisen an den Schnittstellen zwischen zwei Domänenformen eine erhöhte Unordnung auf, was sich u.a. in einer geringeren Packungsdichte der Phospholipide und dem erhöhten Freiheitsgrad ihrer Kopfgruppen bemerkbar macht. Außerdem kommt es auf Grund der Interaktion der beteiligten Membranbestandteile Sphingomyelin und Cholesterol untereinander zu einer speziellen Ausrichtung der Phosphocholin-Kopfgruppen und innerhalb der Raft-artigen Domänen zu einer erhöhten Packungsdichte der Phospholipide. Die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse unterstützten demnach die in der Literatur postulierte Vermutung der bevorzugten Interaktion und Integration der Toxin-Moleküle mit Raft-artigen Membrandomänen. Die Insertion der Pore erfolgt aber wahrscheinlich bevorzugt an den Grenzbereichen zwischen den auftretenden Domänen.rn
AbstractrnrnIn this work two multimeric protein complexes were investigated: On the one hand the Hemocyanin from Homarus americanus was analyzed via X-ray-absorption-spectroscopy at the L-edge, whereas, on the other hand, α-Toxin of Staphylococcus aureus was investigated by Atomic Force Microscopy, in regard to verify a preferred interaction of the toxin with specific raft-like membrane areas.rnIn case of the Homarus americanus hemocyanin we were able to show a new aspect concerning the oxygen binding to the active site, which had not been considered yet. We were able to demonstrate the influence of water molecules onto the active site via L-edge-X-ray-absorption-spectroscopy. For the first time it was possible to investigate the two states of oxygenation of the protein (oxy-, deoxy-) under physiological conditions with this approach. Comparison of the spectra with those received for chemical reference solutions, suggested an interaction of water molecules and the copper atoms of the active site. Therefore a possible influence of water on the oxygenation process of the hemocyanin could be described for the first time on an electronic level. Comparison of known crystal structures, received from different type-3-copper-proteins, confirmed a possible influence of water molecules on the active site. In this context we propose an overlap of the 3d orbitals of the copper atoms with the LUMOs of the water molecules in the deoxygenated state, in contrast to the overlap of 3d copper-orbitals with 2p oxgen-orbitals in the hemocyanins oxygenated state, rendering a metal to ligand charge transfer possible.rnAFM-investigations concerning the interaction of Staphylococcus aureus α-toxin with solid supported membranes showed preferred interaction, and at least partial integration, of the toxin molecules into raft-like membrane areas. For different ternary lipid-systems, phase separated model-membranes could be pictured, and the different domains could be assigned. Preferred adsorption of the toxin molecules thus occurred presumably at the raft-like membrane-domains, whereas pore insertion prior took place at the domain boundaries. Possible causes for this process are the spatial characteristics of these areas. Domain boundaries in membranes are known for their higher disorder, resulting in decreased packing density of the phospholipids and increased flexibility of their head groups. Spatial arrangements between the involved phospholipids Sphingomyelin and Cholesterol lead to a particular orientation of the Phosphocholin head groups and an increased packing density of the involved lipids. The results presented in this work support the postulated assumption of a preferred interaction and integration of toxins in raft-like membrane domains. Insertion of the pore therefore probably occurs at the border area between different membrane domains.rn
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-2113
URN: urn:nbn:de:hebis:77-29372
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: 187 S.
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