Authors:	Wilding, Corina
Title:	Untersuchung des Wirkmechanismus neuroprotektiver Autoantikörper auf retinale Ganglienzellen
Online publication date:	10-Feb-2016
Year of first publication:	2016
Language:	german
Abstract:	Glaukom bezeichnet eine heterogene Gruppe von neurodegenerativen Augenerkrankungen, die mit einem langsamen, progredienten Verlust der retinalen Ganglienzellen und deren Axone einhergehen. Die Pathogenese des Glaukoms ist weitgehend unbekannt. In den letzten Jahren wird die Beteiligung einer autoimmunen Komponente an der Pathogenese des Glaukoms vermutet. Neben komplex veränderten Autoantikörpermustern in Glaukompatienten konnten sowohl veränderte hoch- wie auch herunter-regulierte Autoantikörper detektiert werden. Des Weiteren konnte ein Effekt von Serum und insbesondere in dem Serum befindlichen Antikörpern auf die Proteinexpression von neuroretinalen Zellen nachgewiesen werden. Die Rolle von herunterregulierten Antikörpern ist weitgehend unbekannt, weshalb der Effekt auf neuroretinale Zellen untersucht wurde. Die Inkubation von neuroretinalen Zellen mit herunterregulierten Antikörpern gegen 14-3-3, ɤ-synuclein und GFAP zeigten einen protektiven Effekt gegenüber Stressfaktoren, der sich in einer erhöhten Viabilität sowie in einer erniedrigten ROS-Produktion verdeutlichte. Ein Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der Untersuchung der Mechanismen, die sich hinter dem protektiven Effekt von herunterregulierten Antikörpern verbergen. Für die Untersuchung von veränderten Signalwegen wurden massenspektrometrische Methoden sowie ein Antikörper-Microarray verwendet. Dabei konnte in ɤ-synuclein und 14-3-3 Antikörper behandelten RGC5 anti-apoptotisch veränderte Proteine des mitochondrialen sowie extrinsischen Apoptose Signalweges identifiziert werden. Angehörige Proteine dieses Signalweges sind anti-apoptotisch reguliert und könnten somit beteiligt sein an dem protektiven Effekt von Antikörper behandelten RGC5 gegenüber Stressfaktoren. Des Weiteren wurden signifikant veränderte Proteine des Aktin Zytoskelettweges in GFAP Antikörper inkubierten RGC5 identifiziert. Das Aktin Zytoskelett besteht aus einem dynamischen Auf- und Abbau von Filamenten, welche eine wichtige Rolle bei biologischen Prozessen wie z. Bsp. mechanische Zellstabilität, Zellbewegung, Endozytose und Apoptose, spielt. Die Verknüpfung des Aktin Zytoskelettes mit mitochondrialen apoptotischen Prozessen könnte ebenfalls Hinweise auf eine verminderte Apoptoserate darstellen, wodurch der protektive Effekt von GFAP Antikörpern erklärt werden könnte. Diese Ergebnisse konnten teilweise mittels eines Microarrays validiert werden. Der genaue Mechanismus, der der veränderten Proteinexpression zugrunde liegt, ist unbekannt, weshalb zusätzlich immunhistologische Färbungen durchgeführt wurden. Diese zeigten die Expression von ɤ-synuclein, 14-3-3 sowie GFAP in permeabilisierten RGC5. Des Weiteren konnte die ɤ-synuclein- und 14-3-3- Antikörper Internalisierung in Vesikel in lebenden RGC5 beobachtet werden. Da keine Aufnahme von GFAP Antikörpern in lebenden RGC5 detektiert werden konnte, wurden mittels Westernblot und massenspektrometrischen Analysen mögliche Bindungspartner identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass GFAP Antikörper nicht exklusiv mit seinem Antigen interagiert, sondern ebenfalls mit ERP57. Dies konnte durch immunhistologische Färbungen validiert werden, welche die Bindung von GFAP Antikörper an ERP57 an der Zellmembran von RGC5 zeigte. Der protektive Effekt von Antikörpern könnte zum einen durch die Bindung an ihr Antigen erklärt werden, wodurch dessen Funktion verändert und somit nachfolgende Signalwege verändert werden oder im Fall von GFAP Antikörpern durch die Bindung an ERP57 vermittelt werden. Zur Validierung des protektiven Effektes von herunterregulierten Antikörpern auf RGC5 und zur Untersuchung des Effektes von Antikörpern in dem interagierenden Netzwerk von retinalen Zellen wurde eine retinale Organkultur des adulten Schweines etabliert. Dieses Modell soll ein besseres Verständnis über die Rolle der natürlichen Umgebung von retinalen Ganglienzellen, im Zusammenhang mit dem protektiven Effekt von Antikörpern, liefern. Der protektive Effekt von ɤ-synuclein Antikörpern sowie von GFAP Antikörpern konnte mittels retinaler Organkultur validiert werden. Massenspektrometrische Untersuchungen deuten auf die Beteiligung von retinalen Müllerzellen hin, welche maßgeblich am Überleben von retinalen Ganglienzellen beteiligt sind. Des Weiteren konnte in den Antikörper behandelten Retinaexplantaten ein verminderter ER-Stress detektiert werden, der für den protektiven Effekt der Antikörper auf retinale Ganglienzellen verantwortlich sein könnte. Glaucoma is a heterogeneous neurodegenerative disease defined by a progressive loss of retinal ganglion cells, optic nerve degeneration and progressive visual fields loss, which finally leads to blindness. Although glaucoma is one of the most common cause for blindness worldwide the pathogenesis is still unknown. Studies suggest an immunological component in the pathology of glaucoma. In the serum and aqueous humor of glaucoma patients general complex autoantibody patterns against retinal and optic nerve antigens were found. Studies show not only up-regulated, but also down-regulated antibodies in glaucoma patients. Previous studies incubating neuroretinal cells with the serum and the antibodies of glaucoma patients found changed protein expression patterns in cells incubated with glaucoma serum in comparison to serum from healthy people. The role of down-regulated antibodies are not known. Therefore studies investigating the effect of down-regulated antibodies on stressed neuroretinal cells were done. The incubation of neuroretinal cells with different concentrations of down-regulated antibodies against 14-3-3, ɤ-synuclein and GFAP showing a protective effect, which was shown in an increased viability and a decreased ROS-Level. The focus of my dissertation is the analyses of the mechanism which leads to the protective effect of down-regulated antibodies. Therefore mass spectrometric as well as microarray analyses were implemented in order to detect changed signal pathways in the antibody treated neuroretinal cells. These analyses identified in the 14-3-3- and ɤ-synuclein-antibody treated cells anti-apoptotic changed proteins belonging to the mitochondrial as well as extrinsic apoptotic pathway. These proteins could be participated in the protective effect of the antibodies. Additionally in GFAP antibody treated neuroretinal cells significant changed proteins of the actin cytoskeleton pathway were detected. The actin cytoskeleton consists of a dynamic construction and degradation of filaments, which play an important role in biologically processes like mechanic cell stability, cell movement, endocytosis and apoptosis. The correlation between the actin cytoskeleton and apoptotic processes could be a hint of a decreased apoptosis, which explained the protective effect of the GFAP antibody. These results could be partly validated with a microarray analysis. The exact mechanisms leading to the changed protein expression are not known, therefore immunohistological stainings were implemented. These stainings show the expression of ɤ-synuclein, 14-3-3 as well as GFAP in permeabilized cells. Furthermore the internalization of ɤ-synuclein- and 14-3-3- antibodies in living cells could be shown. An antibody uptake of GFAP antibodies in living cells couldn´t be detected therefore possibly interaction partners could be identified with mass spectrometry as well as westernblot analysis. This analysis could show that GFAP antibodies bind not exclusively to GFAP but also to ERP57. This could be validated with immunohistological stainings, which show the binding of GFAP antibodies on ERP57 on the cell membrane. The protective effect of the antibodies could be explained by the binding on their antigens leading to an altered function and subsequently to changed pathways or in the case of GFAP antibodies mediated through the binding on ERP57. In the next step a retinal organ culture model from the pig was established in order to validate the protective effect of the antibodies and additionally to investigate the effect of antibodies in the interacting network of retinal cells. This model gives a better idea about the role of antibodies in the natural environment of retinal ganglion cells. The protective effect of ɤ-synuclein- and GFAP- antibodies could be validated in the retinal explant culture system. Mass spectrometric analyses point to a participation of Müller cells, which are essential for the survival of retinal ganglion cells. Additionally in the antibody treated explants a decreased ER-stress response could be detected, which is possibly responsible for the protective effect of the antibodies.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1959
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000002376
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XIV, 136 S.
Appears in collections:	JGU-Publikationen