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Authors: Kokkinopoulou, Maria
Title: 3D-ultrastructure, functions and stress responses of rhogocytes from the freshwater gastropods Biomphalaria glabrata and Lymnaea stagnalis
Online publication date: 28-Apr-2015
Language: english
Abstract: Rhogocytes, also termed ‘pore cells’, exist free in the hemolymph or embedded in the connective tissue of different body parts of molluscs, notably gastropods. These unique cells can be round, elongated or irregularly shaped, and up to 30 μm in diameter. Their hallmark is the so-called slit apparatus: i.e. pocket-like invaginations of the plasma membrane creating extracellular lacunae, bridged by cytoplasmic bars. These bars form distinctive slits of ca. 20 nm width. A slit diaphragm composed of proteins establishes a molecular sieve with holes of 20 x 20 nm. Different functions have been assigned to this special molluscan cell type, notably biosynthesis of the hemolymph respiratory protein hemocyanin. It has further been proposed, but not proven, that in the case of red-blooded snail species rhogocytes might synthesize the hemoglobin. However, the secretion pathway of these hemolymph proteins, and the functional role of the enigmatic slit apparatus remained unclear. Additionally proposed functions of rhogocytes, such as heavy metal detoxification or hemolymph protein degradation, are also not well studied. This work provides more detailed electron microscopical, histological and immunobiochemical information on the structure and function of rhogocytes of the freshwater snails Biomphalaria glabrata and Lymnaea stagnalis. By in situ hybridization on mantle tissues, it proves that B. glabrata rhogocytes synthesize hemoglobin and L. stagnalis rhogocytes synthesize hemocyanin. Hemocyanin is present, in endoplasmic reticulum lacunae and in vesicles, as individual molecules or pseudo-crystalline arrays. The first 3D reconstructions of rhogocytes are provided by means of electron tomography and show unprecedented details of the slit apparatus. A highly dense material in the cytoplasmic bars close to the diaphragmatic slits was shown, by immunogold labeling, to contain actin. By immunofluorescence microscopy, the protein nephrin was localized at the periphery of rhogocytes. The presence of both proteins in the slit apparatus supports the previous hypothesis, hitherto solely based on similarities of the ultrastructure, that the molluscan rhogocytes are phylogenetically related to mammalian podocytes and insect nephrocytes. A possible secretion pathway of respiratory proteins that includes a transfer mechanism of vesicles through the diaphragmatic slits is proposed and discussed. We also studied, by electron microscopy, the reaction of rhogocytes in situ to two forms of animal stress: deprivation of food and cadmium contamination of the tank water. Significant cellular reactions to both stressors were observed and documented. Notably, the slit apparatus surface and the number of electron-dense cytoplasmic vesicles increased in response to cadmium stress. Food deprivation led to an increase in hemocyanin production. These observations are also discussed in the framework of using such animals as potential environmental biomarkers.
Rhogocyten, auch Porenzellen genannt, existieren frei in der Hämolymphe oder eingebettet im Bindegewebe verschiedener Körperteile von Mollusken, insbesondere von Gastropoden (Schnecken). Sie können rund, länglich oder irregulär geformt sein und besitzen einen Durchmesser von bis zu 30 μm. Ihr auffälligstes Merkmal ist der so genannte Schlitzapparat; dabei handelt es sich um taschenförmige Einstülpungen der Plasmamembran, wodurch extrazelluläre, von cytoplasmatischen Stäben überbrückte Lakunen entstehen. Zwischen diesen Stäben existieren auffällige Schlitze von ca. 20 nm Breite. Ein Schlitz-Diaphragma aus Proteinen bildet ein Molekularsieb mit Filtrationsporen von 20 × 20 nm. Diesem besonderen Zelltyp der Mollusken hat man eine ganze Reihe von Funktionen zugeschrieben, insbesondere die Produktion des respiratorischen Hämolympheproteins Hämocyanin. Zudem wurde vermutet, aber noch nicht nachgewiesen, dass die Rhogocyten bei Schneckenarten mit rotem Blut das Hämoglobin produzieren. Die Sekretionswege dieser Hämolympheproteine und die funktionelle Rolle des Schlitzapparats blieben unklar. Zusätzlich vorgeschlagene Funktionen von Rhogocyten, wie Schwermetallentgiftung oder der Abbau von Hämolympheproteinen, sind ebenfalls nicht gut untersucht. Die vorliegende Arbeit liefert detaillierte elektronenmikroskopische, histologische und immunobiochemische Informationen zur Struktur und Funktion von Rhogocyten der Süsswasserschnecken Biomphalaria glabrata und Lymnaea stagnalis. Sie zeigt durch in situ Hybridisierung von Mantelgewebe, dass Rhogocyten von B. glabrata Hämoglobin und solche von L. stagnalis Hämocyanin synthetisieren. Hämocyanin wurde teils als pseudokristalline Felder, teils als Einzelmoleküle in Lakunen des Endoplasmatischen Reticulums sowie in Vesikeln beobachtet. Mittels Elektronen- tomographie wurden hier die ersten 3D-Rekonstruktionen von Rhogocyten erstellt; sie zeigen den Schlitzapparat in bisher nicht erreichten Details. Dabei wurde in den cytoplasmatischen Stäben nahe den Schlitzen ein hochdichtes Material beobachtet. Durch Immunogoldmarkierung wurden Belege dafür gesammelt, dass Aktin eine der Komponenten dieses Materials ist. Mittels Immunofluoreszenzmikroskopie konnte in der Peripherie der Rhogocyten das Protein Nephrin lokalisiert werden. Die Anwesenheit dieser beiden Proteine unterstützt die zuvor ausschließlich auf Ähnlichkeiten in der Ultrastruktur basierende Hypothese, dass die Rhogocyten der Mollusken phylogenetisch mit den Podocyten der Vertebraten und Nephrocyten der Insekten verwandt sind. Ein möglicher Sekretionsweg der respiratorischen Proteine, der einen Transfermechanismus von Vesikeln durch die diaphragmatischen Schlitze einschließt, wird vorgeschlagen und diskutiert. Zudem wurde die Reaktion von Rhogocyten in situ auf zwei Formen von Tierstress elektronen- mikroskopisch untersucht: Entzug von Nahrung und Cadmiumbelastung des Wohnwassers. Es wurden signifikante zelluläre Reaktionen auf beide Stressoren beobachtet und dokumentiert. Als Reaktion auf Cadmiumbelastung vergrößerte sich die Oberfläche des Schlitzapparats und erhöhte sich die Anzahl an elektronendichten cytoplasmatischen Vesikeln. Nahrungsentzug führte zu einer vermehrten Produktion von Hämocyanin. Diese Beobachtungen wurden auch unter dem Gesicht- spunkt einer Verwendung dieser Tiere als potentielle Umwelt-Biomarker diskutiert.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1825
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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