The role of plasma cell-free DNA as predictor of clinical outcome in heart failure – Results from the MyoVasc study

Abstract

Heart failure (HF) represents a major cause of mortality with a prevalence of 1-2% in the adult population in developed countries. As populations age, the role of HF is expected to grow. This comes with a steep increase in healthcare costs, placing a substantial burden on society. Identifying HF risk patients earlier, possibly even before symptoms manifest, becomes crucial to initiate interventions promptly, such as lifestyle adjustments or medication. In preventive medicine, the identification of suitable biomarkers plays a key role, as they allow an objective and early disease detection. Cell-free DNA (cfDNA) is a widely used diagnostic biomarker in clinical fields like oncology or transplantation medicine. In clinical cardiology, however, cfDNA analytics does not yet play a major role. Only a handful of rather small-scale studies have so far investigated the potential of cfDNA diagnostics in HF patients, indicating that cfDNA could be an independent risk factor for cardiovascular disease and overall mortality. The aim of the present study was therefore to evaluate the potential of cfDNA in HF diagnostics in a large cohort of subjects and to compare its predictive power to the currently most often used biomarker, NT-proBNP. To achieve this, a reliable, reproduceable, and quick high throughput cfDNA quantification method needed to be implemented. The existing manual, time- and labour-consuming qPCR assay was automated by testing and establishing an INTEGRA pipetting robot and tuning its workflow to the special needs of high-viscosity plasma samples. The assay was adjusted to reliably produce the same test results as with the already published qPCR assay established by Neuberger et al. (183). This way a consistent measuring of the study samples was ensured. cfDNA levels were then quantified in 3109 EDTA plasma samples from the prospective MyoVasc study (NCT04064450). Two qPCR assays of different amplicon lengths (cfDNA90 bp/ cfDNA222 bp), both targeting a repetitive LINE1 element, were used for cfDNA quantification and to calculate the cfDNA integrity index, which indicates the fragmentation level of the cfDNA. Competing risk models were applied to investigate the associations of cfDNA with worsening of HF, and Cox proportional hazard regression analyses were used to assess the endpoints of cardiac death and all-cause death. C-statistics were calculated and compared for each model. The participants were classified as 0 (healthy) or HF stages A (at risk for HF) to D (advanced HF) according to the current Universal Definition of Heart Failure. Analyses were adjusted for age, sex, cardiovascular risk factors (CVRFs) and medication (models 1-3) and additionally for NT-proBNP (model 4). Outcome data were presented as cumulative incidence plots for cfDNA90bp and 222bp levels and for the integrity index. The cohort included 3109 study participants with an age between 34 to 85 years and 35.7% females. cfDNA concentration was lowest in stage 0/A subjects (n=534) with 10.99 (8.70/13.93) ng/ml (median (Q1/Q3)). Stage B (pre-HF) (n=923) or stage C/D subjects (n=1652) showed elevated cfDNA90bp concentrations with 13.37 (10.35/18.11) or 17.11 (12.56/22.80) ng/ml, respectively. Cox proportional hazard regression analyses indicated that the concentration of cfDNA90bp is a relevant prognostic marker for all-cause death, adjusted for age, sex, CVRFs and medication (HR = 1.312 [1.205-1.430], p < 0.0001). After additional adjustment for NT-proBNP, the effect estimates were lower, but still statistically significant (HR = 1.173 [1.073-1.282], p = 0.00046). Regarding the endpoints worsening of HF and cardiac death, the effect estimates were no longer significant after adjustment for NT-proBNP. A C- index comparison showed the same tendency, with a significant added value of testing cfDNA additionally to NT-proBNP only when looking at all-cause death (C = 0.807 vs. C = 0.805; p = 0.050). However, cumulative incidence plots for dichotomised values of NT-proBNP and cfDNA showed the highest incidence rates for all three outcomes in patients with elevations in both biomarkers, significantly higher than in patients with elevations of NT-pro BNP alone. The present results indicate that cfDNA is a risk factor, which independently of NT-proBNP contributes to the prediction of overall mortality (all-cause death) in the study cohort. cfDNA also appears to possess additional information value to NT-proBNP for predicting worsening of HF and cardiac death.

Herzinsuffizienz (HI) ist mit einer Prävalenz von 1 bis 2 % in der erwachsenen Bevölkerung eine der Haupttodesursachen in den Industrieländern. Mit zunehmender Alterung der Bevölkerung wird auch die Bedeutung der HI in den kommenden Jahren zunehmen. Dies geht mit einem starken Anstieg der Gesundheitskosten einher und stellt eine erhebliche Belastung für die Gesellschaft dar. Die Identifizierung von HI-Risikopatienten zu einem früheren Zeitpunkt, möglicherweise sogar noch vor Auftreten von Symptomen, ist von entscheidender Bedeutung, um rechtzeitig Maßnahmen wie Lebensstiländerungen oder eine medikamentöse Therapie einleiten zu können. In der Präventivmedizin spielt die Identifizierung geeigneter Biomarker eine Schlüsselrolle, da sie eine objektive und frühzeitige Krankheitserkennung ermöglichen. Zellfreie DNA (cfDNA) ist ein weit verbreiteter diagnostischer Biomarker in klinischen Bereichen wie der Onkologie oder der Transplantationsmedizin. In der klinischen Kardiologie spielt die cfDNA-Analytik jedoch bislang noch keine große Rolle. Nur eine Handvoll eher kleinerer Studien hat bisher das Potenzial der cfDNA-Diagnostik bei HI-Patienten untersucht. Diese Arbeiten deuten jedoch darauf hin, dass cfDNA ein unabhängiger Risikofaktor für Herz-Kreislauf-Erkrankungen und die Gesamtmortalität sein könnte. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, das Potenzial von cfDNA in der HI-Diagnostik in einer größeren Studienkohorte zu untersuchen und ihre Vorhersagekraft mit dem derzeit am häufigsten verwendeten Biomarker, NT-proBNP, zu vergleichen. Um dies zu erreichen, musste eine zuverlässige, reproduzierbare und schnelle Hochdurchsatzmethode zur Quantifizierung von cfDNA implementiert werden. Der bestehende manuelle, zeit- und arbeitsaufwändige qPCR-Assay wurde durch die Erprobung und Etablierung eines INTEGRA-Pipettierroboters automatisiert und dessen Arbeitsablauf auf die speziellen Bedürfnisse hochviskoser Plasmaproben hin abgestimmt. Der Assay wurde so angepasst, dass er zuverlässig die gleichen Testergebnisse liefert wie der bereits publizierte qPCR-Assay von Neuberger et al. (182). Auf diese Weise wurde eine konsistente Messung der Studienproben sichergestellt. Die cfDNA-Konzentration wurde in 3109 EDTA-Plasmaproben der prospektiven MyoVasc-Studie (NCT04064450) analysiert. Zur Quantifizierung der cfDNA und zur Berechnung des cfDNA-Integritätsindex wurden zwei qPCR-Assays mit unterschiedlichen Amplikonlängen (cfDNA90 bp/ cfDNA222 bp) verwendet, die beide auf ein repetitives LINE1-Element abzielen. Um die Assoziationen von cfDNA mit der Verschlechterung von HI zu untersuchen, wurden “Competing risk models“ angewandt. Cox-Proportional-Hazard-Regressionsanalysen wurden verwendet, um die Endpunkte Herztod und Gesamtmortalität zu bewerten. Zusätzlich wurden C-Statistiken für jedes Modell berechnet und verglichen. Die Teilnehmer wurden als 0 (gesund) oder als HI-Stadien A (Risiko für HI) bis D (fortgeschrittene HI) gemäß der aktuellen universellen Definition der Herzinsuffizienz eingestuft. Die Analysen wurden für Alter, Geschlecht, kardiovaskuläre Risikofaktoren (CVRF) und Medikamente (Modelle 1-3) sowie zusätzlich für NT-proBNP (Modell 4) adjustiert. Die Ergebnisse wurden als kumulative Inzidenzdiagramme für die cfDNA-Assays 90bp und 222bp sowie für den Integritätsindex, der den Fragmentierungsgrad der cfDNA beschreibt, dargestellt. Die Kohorte umfasste 3109 Studienteilnehmer mit einem Alter zwischen 34 und 85 Jahren bei einem Frauen-Anteil von 35,7 %. Personen im Stadium 0/A (n=534) zeigten mit 10,99 (8,70/13,93) ng/ml (Median (Q1/Q3)) die niedrigsten cfDNA90bp-Konzentrationen. Probanden im Stadium B (prä-HI) (n=923) oder im Stadium C/D (n=1652) wiesen erhöhte cfDNA90bp-Konzentrationen von 13,37 (10,35/18,11) bzw. 17,11 (12,56/22,80) ng/ml auf. Cox-Proportional-Hazard-Regressionsanalysen zeigten, dass die cfDNA90bp-Konzentration ein relevanter prognostischer Marker für die Gesamtmortalität ist, sofern eine Adjustierung für Alter, Geschlecht, CVRF und Medikation vorgenommen wurde (HR = 1,312 [1,205-1,430], p < 0,0001). Nach zusätzlicher Adjustierung für den etablierten Marker NT-proBNP waren die Effektschätzungen geringer, aber immer noch statistisch signifikant (HR = 1,173 [1,073-1,282], p = 0,00046). Für die Endpunkte „Verschlechterung der HF“ und „Herztod“ waren die Effektschätzer nach Adjustierung für NT-proBNP hingegen nicht mehr statistisch signifikant. Ein C-Index-Vergleich zeigte ebenfalls einen statistisch signifikanten Zusatznutzen der cfDNA zusammen mit der Bestimmung von NT-proBNP bei Betrachtung der Gesamtmortalität (C = 0,807 vs. C = 0,805; p = 0,050). Diagramme für kumulative Inzidenzen von NT-proBNP- und cfDNA-Werten (dichotomisiert) zeigten die höchsten Inzidenzraten hingegen sogar für alle drei Endpunkte bei Patienten mit gleichzeitiger Erhöhung beider Biomarker. Die Inzidenzen waren signifikant höher als bei Patienten mit einer reinen Erhöhung von NT-pro BNP. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass cfDNA ein Risikofaktor ist, der unabhängig von NT-proBNP zur Vorhersage der Gesamtmortalität in der Studienkohorte beiträgt. cfDNA besitzt offenbar auch einen zusätzlichen Nutzen zu NT-proBNP für die Vorhersage einer Verschlechterung der HI und des Herztodes.