Untersuchungen zur Zusammensetzung des Tumormikromilieus unter Betrachtung des Transkriptoms, Proteoms und Sekretoms ausgewählter Tumorzelllinien

Abstract

Die Erforschung des Tumormikromilieus ist entscheidend, um Kommunikations- und Signalwege zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung besser zu verstehen und potentielle therapeutische Angriffspunkte zu identifizieren. Die Sekretomanalyse mit-tels massenspektrometrischer Messung bietet dabei die Möglichkeit, von Tumorzellen sekretierte Proteine zu detektieren und Übersichten über die Sekretome verschiedener Tumorzellen zu erstellen. Hierzu wurden bereits verschiedene Methoden etabliert. In dieser Arbeit hat die Methode des „SILAC labelings und der Click-Chemistry“ von Kathrin Eichelbaum und Jeroen Krijgsveld Anwendung gefunden, die bislang den Goldstandard der Sekretomanalyse darstellte. Bei der Anwendung auf zehn humane Tumorzelllinien wurden zwischen 234 und 692 Proteine pro Zelllinie identifiziert, die miteinander verglichen wurden, wodurch eine Übersicht über die gemeinsam sekretierten Proteine erstellt werden konnte. Ergänzend wurden neben dem Sekretom auch Transkriptom- und Proteomdaten er-stellt, um die Methode näher zu untersuchen und zu validieren. GO-Analysen dieser Daten zeigten, dass das bei dieser Methode zur Markierung der neu synthetisierten Proteine eingesetzte Aminosäureanalogon L-Azidohomoalanin Stress- und Apopto-sereaktionen in den Zellen auslöst, die sich auch auf das Sekretom auswirken könn-ten. Untermauert wurde diese Beobachtung durch tiefergehende Untersuchungen der Mauszelllinie MC38. Die Erstellung von Wachstumskurven und der Einsatz durchflusszytometrischer Untersuchungen von mit Apoptosemarkern gefärbten Zellen in der Kultur bestätigten diese Erkenntnis. Insbesondere bei langsam wachsenden oder empfindlichen Zelllinien sowie primären Zellen stößt diese Methode der Sekretomanalyse an ihre Grenzen. Ursächlich hierfür ist, dass das L-Azidohomoalanin nicht nur eine Stressreaktion in den Zellen auslöst sondern auch nicht effektiv in die sekretierten Proteine eingebaut wird. Um diese Effekte zu reduzieren wurde in dieser Arbeit eine alternative Methode der Sekretomanalyse entwickelt, bei der keine, die Zellen irritierenden Aminosäureanaloga zur Markierung der neu synthetisierten Proteine eingesetzt werden. Dazu wurde eine Medienkombination ermittelt, in der die Zellen ohne den Zusatz von fötalem Kälberserum, das bislang die massenspektrometrische Messung behinderte, kultiviert werden können, sodass auf eine Markierung zur Differenzierung verzichtet werden kann. Die hier entwickelte Methode ermöglicht es somit, durch einen geringeren Stresseinfluss auf die Zellen ein natürlicheres Sekretom zu erstellen. Außerdem erweitert diese Methode das Spektrum der detektierbaren Proteine auch auf die, deren Aminosäuresequenz kein Methionin enthält.

The analysis of the tumor microenvironment is crucial for a better understanding of the communication and signaling pathways between tumor cells and their environment and for the identification of potential therapeutic targets. Secretome analysis using mass spectrometry offers the possibility to detect proteins secreted by tumor cells and to create overviews of the secretome of various tumor cells. For this purpose, various methods have already been established. In this work, the method of “SILAC labeling and click chemistry” by Kathrin Eichelbaum and Jeroen Krijgsveld was used, which represents the gold standard for secretome analysis. When applied to the ten human tumor cell lines, examined in this work, between 234 and 692 secreted proteins per cell line were identified, compared to each other and an overview of the co-secreted proteins was created. In addition to the secretome, transcriptome and proteome data were generated in order to examine and validate the method in detail. GO analyzes of these data showed, that the amino acid analogue L-azidohomoalanin, used in this method to label newly synthesized proteins, triggers stress and apoptosis reactions in the cells, which could have an effect on the secretome. This was supported by in-depth studies of the mouse cell line MC38, specifically analyzing growth curves and using cytometric-based examinations of the cells stained with apoptosis markers. Particularly with slowly growing or sensitive cell lines as well as primary cells, this secretome analysis method seems to reach its limits, as the L-azidohomoalanine not only triggers a stress reaction in the cells, but is also not effectively incorporated into the secreted proteins. In order to reduce this effect, an alternative method of secretome analysis was developed in which no amino acid analogues are used to label the newly synthesized proteins. Therefor a media combination was determined in which the cells can be cultured without the addition of fetal calf serum, which interferes with the mass spectrometric analysis. This new method enables to create a more natural secretome by reducing the impact of stress on the cells and also to detect proteins whose amino acid sequence does not contain methionine