Untersuchungen zur Zusammensetzung des Tumormikromilieus unter Betrachtung des Transkriptoms, Proteoms und Sekretoms ausgewählter Tumorzelllinien
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Die Erforschung des Tumormikromilieus ist entscheidend, um Kommunikations- und Signalwege zwischen Tumorzellen und ihrer Umgebung besser zu verstehen und potentielle therapeutische Angriffspunkte zu identifizieren. Die Sekretomanalyse mit-tels massenspektrometrischer Messung bietet dabei die Möglichkeit, von Tumorzellen sekretierte Proteine zu detektieren und Übersichten über die Sekretome verschiedener Tumorzellen zu erstellen. Hierzu wurden bereits verschiedene Methoden etabliert. In dieser Arbeit hat die Methode des „SILAC labelings und der Click-Chemistry“ von Kathrin Eichelbaum und Jeroen Krijgsveld Anwendung gefunden, die bislang den Goldstandard der Sekretomanalyse darstellte. Bei der Anwendung auf zehn humane Tumorzelllinien wurden zwischen 234 und 692 Proteine pro Zelllinie identifiziert, die miteinander verglichen wurden, wodurch eine Übersicht über die gemeinsam sekretierten Proteine erstellt werden konnte.
Ergänzend wurden neben dem Sekretom auch Transkriptom- und Proteomdaten er-stellt, um die Methode näher zu untersuchen und zu validieren. GO-Analysen dieser Daten zeigten, dass das bei dieser Methode zur Markierung der neu synthetisierten Proteine eingesetzte Aminosäureanalogon L-Azidohomoalanin Stress- und Apopto-sereaktionen in den Zellen auslöst, die sich auch auf das Sekretom auswirken könn-ten. Untermauert wurde diese Beobachtung durch tiefergehende Untersuchungen der Mauszelllinie MC38. Die Erstellung von Wachstumskurven und der Einsatz durchflusszytometrischer Untersuchungen von mit Apoptosemarkern gefärbten Zellen in der Kultur bestätigten diese Erkenntnis. Insbesondere bei langsam wachsenden oder empfindlichen Zelllinien sowie primären Zellen stößt diese Methode der Sekretomanalyse an ihre Grenzen. Ursächlich hierfür ist, dass das L-Azidohomoalanin nicht nur eine Stressreaktion in den Zellen auslöst sondern auch nicht effektiv in die sekretierten Proteine eingebaut wird. Um diese Effekte zu reduzieren wurde in dieser Arbeit eine alternative Methode der Sekretomanalyse entwickelt, bei der keine, die Zellen irritierenden Aminosäureanaloga zur Markierung der neu synthetisierten Proteine eingesetzt werden. Dazu wurde eine Medienkombination ermittelt, in der die Zellen ohne den Zusatz von fötalem Kälberserum, das bislang die massenspektrometrische Messung behinderte, kultiviert werden können, sodass auf eine Markierung zur Differenzierung verzichtet werden kann. Die hier entwickelte Methode ermöglicht es somit, durch einen geringeren Stresseinfluss auf die Zellen ein natürlicheres Sekretom zu erstellen. Außerdem erweitert diese Methode das Spektrum der detektierbaren Proteine auch auf die, deren Aminosäuresequenz kein Methionin enthält.