Interaktion von Astacin-Metalloproteasen mit dem Plasmaprotein Fetuin-A aus Cyprinus carpio
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Proteasen der Astacinfamilie wurden bisher in allen Großgruppen biologischer Organismen – außer den Pflanzen – gefunden. Der Mensch besitzt sechs Gene dieser Familie. Beispielsweise während der Befruchtung der Eizelle, der Entwicklung und der Kollagenassemblierung übernehmen diese Proteasen wichtige Funktionen. Ist die Expression oder die Aktivität dieser Proteasen nicht adequat reguliert, kann dies zu verschiedenen Krankheiten führen. Demzufolge ist die Kenntnis ihrer Regulation durch aktivierende Faktoren oder Inhibitoren notwendig. Diese Arbeit soll zur Aufklärung der Funktionsweise des endogenen Hemmstoffs Fetuin beitragen. Der Inhibitor Fisch-Fetuin-A wurde erstmals 2004 zusammen mit der Astacinprotease Nephrosin aus den hematopoietischen Geweben des Karpfens isoliert. Im Menschen wurden die Fetuine-A und -B identifiziert, welche unterschiedliche Funktionen im Organismus übernehmen.
Die aktive Form des verkürzten Fisch-Fetuins-A wurde mit Hilfe des pQE-TriSystem His∙Strep Vektor 2 in E. coli M15[pREP4] exprimiert, unter denaturierenden Bedingungen affinitätschromatographisch isoliert und in die native, funktionelle Konformation gefaltet. Durch den Expressionsvektor erhält das Fusionsprotein einen N-terminalen Strep-tag und einen C-terminalen His-tag, welche unter anderem für die Reinigung und die Identifizierung genutzt wurden. Die Metalloproteasen Meprin α und Meprin β schneiden den Inhibitor an definierten Positionen. Meprin α schneidet im N-terminalen und Meprin β im C-terminalen Bereich der Fisch-Fetuin-A Sequenz. Dabei ist die Spaltung durch Meprin β schneller. Für Astacin ist der Inhibitor kein Substrat. Kinetische Messungen mit Astacin lassen auch darauf schließen, dass Fisch-Fetuin-A diese Protease nicht hemmt. Meprine hingegen werden gehemmt. Die Inhibitionskonstante Ki für Fisch-Fetuin-A mit Meprin α beträgt 115 nM und mit Meprin β 556 nM und weist so Fisch-Fetuin-A als physiologisch relevanten Inhibitior dieser Astacin¬prote-asen aus. Außerdem konnte die Hemmung der Astacinprotease Nephrosin aus Danio rerio (Zebrafisch) und Trypsin gezeigt werden. Weitere Serin¬proteasen und die Cysteinprotease Papain wurden nicht durch Fisch-Fetuin-A gehemmt.
Aufgrund der Substratpräferenz der Meprine wurde vermutet, dass bei der Inhibition der Astacinproteasen eine negativ geladene Aminosäure eine Rolle spielen könnte. Die D144A-Fisch-Fetuin-A-Mutante zeigte jedoch kein verändertes Verhalten gegenüber Meprin α. In Sequenzvergleichen wurde besonderes Augenmerk auf saure Reste in der Aminosäuresequenz des Fisch-Fetuins-A gelegt. Außerdem wurden die Strukturen der beiden Cystatin-ähnlichen Domänen von Fisch-Fetuin-A, humanem Fetuin-A und humanem Fetuin-B berechnet. Auch diese Strukturen wurden auf exponierte, negativ geladene Reste untersucht, welche inhibitorische Funktionen übernehmen könnten. Diese Daten grenzen den inhibitorisch aktiven Bereich auf die α-Helix der zweiten Cystatin-ähnlichen Domäne oder den Bereich zwischen den β-Faltblattsträngen β3 und β4 ein und legen den Grundstein weiterer Analysen. Weitere Untersuchungen sollten sich daher einerseits auf die Reste Glu158 bzw. Glu169 von Fetuin-A bzw. B und anderseits auf den ungeordneten Bereich, welcher gegenüber der beiden loops L1 und L2 liegt, konzentrieren.
Bisher ist noch kein Mechanismus der Regulation von Astacinen durch endogene Inhibitoren aufgeklärt. Mit dieser Arbeit wird zum einen ein umfangreicheres Bild der Typ III Cystatine, insbesondere der Fetuine, präsentiert. Zum anderen werden potentielle inhibitorische Positionen der Fetuine auf ein überschaubares Maß reduziert. Nun gilt es, diese Thesen zu prüfen.