Authors:	Meyer, Katharina Maria
Title:	Interaktion von Astacin-Metalloproteasen mit dem Plasmaprotein Fetuin-A aus Cyprinus carpio
Online publication date:	2-Dec-2016
Year of first publication:	2016
Language:	german
Abstract:	Proteasen der Astacinfamilie wurden bisher in allen Großgruppen biologischer Organismen – außer den Pflanzen – gefunden. Der Mensch besitzt sechs Gene dieser Familie. Beispielsweise während der Befruchtung der Eizelle, der Entwicklung und der Kollagenassemblierung übernehmen diese Proteasen wichtige Funktionen. Ist die Expression oder die Aktivität dieser Proteasen nicht adequat reguliert, kann dies zu verschiedenen Krankheiten führen. Demzufolge ist die Kenntnis ihrer Regulation durch aktivierende Faktoren oder Inhibitoren notwendig. Diese Arbeit soll zur Aufklärung der Funktionsweise des endogenen Hemmstoffs Fetuin beitragen. Der Inhibitor Fisch-Fetuin-A wurde erstmals 2004 zusammen mit der Astacinprotease Nephrosin aus den hematopoietischen Geweben des Karpfens isoliert. Im Menschen wurden die Fetuine-A und -B identifiziert, welche unterschiedliche Funktionen im Organismus übernehmen. Die aktive Form des verkürzten Fisch-Fetuins-A wurde mit Hilfe des pQE-TriSystem His∙Strep Vektor 2 in E. coli M15[pREP4] exprimiert, unter denaturierenden Bedingungen affinitätschromatographisch isoliert und in die native, funktionelle Konformation gefaltet. Durch den Expressionsvektor erhält das Fusionsprotein einen N-terminalen Strep-tag und einen C-terminalen His-tag, welche unter anderem für die Reinigung und die Identifizierung genutzt wurden. Die Metalloproteasen Meprin α und Meprin β schneiden den Inhibitor an definierten Positionen. Meprin α schneidet im N-terminalen und Meprin β im C-terminalen Bereich der Fisch-Fetuin-A Sequenz. Dabei ist die Spaltung durch Meprin β schneller. Für Astacin ist der Inhibitor kein Substrat. Kinetische Messungen mit Astacin lassen auch darauf schließen, dass Fisch-Fetuin-A diese Protease nicht hemmt. Meprine hingegen werden gehemmt. Die Inhibitionskonstante Ki für Fisch-Fetuin-A mit Meprin α beträgt 115 nM und mit Meprin β 556 nM und weist so Fisch-Fetuin-A als physiologisch relevanten Inhibitior dieser Astacin¬prote-asen aus. Außerdem konnte die Hemmung der Astacinprotease Nephrosin aus Danio rerio (Zebrafisch) und Trypsin gezeigt werden. Weitere Serin¬proteasen und die Cysteinprotease Papain wurden nicht durch Fisch-Fetuin-A gehemmt. Aufgrund der Substratpräferenz der Meprine wurde vermutet, dass bei der Inhibition der Astacinproteasen eine negativ geladene Aminosäure eine Rolle spielen könnte. Die D144A-Fisch-Fetuin-A-Mutante zeigte jedoch kein verändertes Verhalten gegenüber Meprin α. In Sequenzvergleichen wurde besonderes Augenmerk auf saure Reste in der Aminosäuresequenz des Fisch-Fetuins-A gelegt. Außerdem wurden die Strukturen der beiden Cystatin-ähnlichen Domänen von Fisch-Fetuin-A, humanem Fetuin-A und humanem Fetuin-B berechnet. Auch diese Strukturen wurden auf exponierte, negativ geladene Reste untersucht, welche inhibitorische Funktionen übernehmen könnten. Diese Daten grenzen den inhibitorisch aktiven Bereich auf die α-Helix der zweiten Cystatin-ähnlichen Domäne oder den Bereich zwischen den β-Faltblattsträngen β3 und β4 ein und legen den Grundstein weiterer Analysen. Weitere Untersuchungen sollten sich daher einerseits auf die Reste Glu158 bzw. Glu169 von Fetuin-A bzw. B und anderseits auf den ungeordneten Bereich, welcher gegenüber der beiden loops L1 und L2 liegt, konzentrieren. Bisher ist noch kein Mechanismus der Regulation von Astacinen durch endogene Inhibitoren aufgeklärt. Mit dieser Arbeit wird zum einen ein umfangreicheres Bild der Typ III Cystatine, insbesondere der Fetuine, präsentiert. Zum anderen werden potentielle inhibitorische Positionen der Fetuine auf ein überschaubares Maß reduziert. Nun gilt es, diese Thesen zu prüfen. The active form of the shortened fish fetuin-A was expressed in E. coli M15 [pREP4] with the help of the pQE-TriSystem His ∙ Strep Vector 2. It was isolated by affinity-chromatography under denaturing conditions and folded into the native functional conformation. The fusion protein received a N-terminal strep-tag and a C-terminal His-tag through the expression vector. These tags were used, inter alia, for purification and identification. The metalloproteases Meprin α and Meprin β do cleave the inhibitor at defined positions. Meprin α cleaves in the N-terminal part and Meprin β in the C-terminal region of the fish-fetuin-A sequence. The cleavage by Meprin β is faster. The inhibitor is not a substrate for Astacin. Kinetic measurements with astacin also suggest that fish-fetuin-A does not inhibit this protease. On the other hand meprins are inhibited. The inhibition constant Ki for fish-fetuin-A with meprin α is 115 nM and with meprin β is 556 nM. This thus indicates that fish-fetuin-A might be a physiologically relevant inhibitor of these astacin proteases. In addition, the inhibition of the astacin protease nephrosin from Danio rerio (zebrafish) and trypsin was shown. Additional serine proteases and the cysteine protease papain were not inhibited by fish fetuin A. Due to the substrate preference of the meprins it was assumed that a negatively charged amino acid might play a role in the inhibition of the astacin proteases. However, the D144A-fish-fetuin-A mutant showed no altered behavior towards meprin α. In sequence comparisons, attention was paid to acidic residues in the amino acid sequence of fish-fetuin-A. In addition, the structures of the two cystatin-like domains of fish fetuin-A, human fetuin-A and human fetuin-B were calculated. These structures were also investigated for exposed, negatively charged residues, which could take on inhibitory functions. These data bound the inhibitory active region to the α-helix of the second domain or the region between the β-fold leaf strings β3 and β4 and lay the foundation for further analyzes. Further investigations should therefore focus on the residues Glu158 or Glu169 of Fetuin-A or B and on the other hand on the disordered area, which lies opposite the two loops L1 and L2. These data limit the inhibitory active region to the α-helix of the second cystatin-like domain or the region between the strings β3 and β4 of the β-sheet and is the key for further analyzes. Further investigations should therefore focus on the residues Glu158 or Glu169 of fetuin-A or B and on the other hand on the disordered area, which lies opposite the two loops L1 and L2. The mechanism of astacin regulation by endogenous inhibitors has not been elucidated to date. On the one hand this work does present a more comprehensive picture of the type III cystatins, especially the fetuins. On the other hand, potential inhibitory positions of the fetuins are reduced to a manageable level. Now it is necessary to examine these theses.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4579
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000008402
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	x, 142 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen