The role of the GABAA receptor-stabilizing protein ubiquilin-1 in a mouse model of in vitro epilepsy

Abstract

For more than ten years following a traumatic brain injury (TBI), the risk of being diagnosed with posttraumatic epilepsy (PTE) is substantially increased (104). PTEs constitute an increasing socioeconomic and global public health concern and thus, a large proportion of acquired epilepsies (97, 99). To this day, no effective and antiepileptogenic treatment strategy has been implemented in clinical practice and therefore remains a challenging subject of research (98). With the advent of newer techniques in epilepsy research, the deciphering of the pathophysiology underlying posttraumatic epileptogenesis is steadily improving. The use of animal models of epilepsy and TBI is of great significance for the discovery of biomarkers or potential therapeutic interventions (56). For this purpose, specific molecular targets with an altered expression during TBI-inflicted epileptogenesis prove promising for devising antiepileptogenic treatment strategies (98). By using our established animal models of TBI and in vitro epilepsy, we gained new insights into the regulation of the GABAA receptor-interacting protein ubiquilin-1. Recent studies have demonstrated that ubiquilin-1 is strongly regulated in epilepsy (64), ischemic brain injuries (121) as well as in neurodegenerative diseases, e.g. Alzheimer’s and Huntington’s disease (118, 120). In the preliminary work for this study, a quantitative approach of proteomic analysis on isolated GFP+ interneurons from the contralateral hemisphere after unilateral TBI-induction was implemented to identify target proteins implicated in posttraumatic brain injury mechanisms. The label-free quantification in cortical GABAergic interneurons from CCI-treated GAD67-GFP mice revealed a significant downregulation of ubiquilin-1 24 hours post-lesion. To investigate the common features between this regulation post-TBI and epilepsy, we implemented an epilepsy model to study the ubiquilin-1 expression in slices from the cortex and hippocampus. In the present study, epileptiform activity was induced in vitro by application of the combination of kainic acid (KA, 500 nM) and the GABAA receptor antagonist picrotoxin (PTX, 50 μM). These chemoconvulsives have already been established as a highly reliable in vitro model of epilepsy by Ridler et al. (170). We monitored the highly repetitive occurrence of seizure-like events (SLEs) with extracellular multielectrode array (MEA) recordings in the hippocampal CA1 region of acute brain slices. Following the induction of epileptiform events, we quantified the expression of our target ubiquilin-1 in hippocampal and cortical slices in a time window of up to seven hours after seizure induction with Western blots. Here, we disclosed a reduction of ubiquilin-1 expression at all time points of incubation in both the hippocampus and the cortex. Next, we successfully performed a pharmacological rescue in order to recover the previously diminished ubiquilin-1 levels by use of the non-selective monoamine oxidase inhibitor nialamide (NM,10 μM). Our Western blot data raised the question of whether an upregulation of ubiquilin-1 expression would alter the properties of in vitro epileptiform activity. Therefore, we recorded dose-response relationships by applying increasing concentrations of PTX (0-100 - 82 - μM). Interestingly, the application of NM during MEA recordings substantially alleviated epileptiform activity with regard to the number of SLEs and the mean peak amplitudes. Our observation indicates that aside from a restored ubiquilin-1 expression, the different monoamine transmitter systems might contribute to this epileptostatic effect and have a great potential for future investigations.

Für einen Zeitraum von mehr als zehn Jahren nach einer traumatischen Hirnverletzung (TBI) ist das Risiko, die Diagnose Posttraumatische Epilepsie (PTE) zu erhalten, deutlich erhöht (104). Posttraumatische Epilepsien stellen ein wachsendes sozioökonomisches Problem der öffentlichen Gesundheit weltweit dar und machen einen großen Anteil der erworbenen Epilepsien aus (97, 99). Bis heute wurde keine effektive und anti-epileptogene Therapie in die klinische Praxis umgesetzt und bleibt daher weiterhin ein herausfordernder Gegenstand der aktuellen Forschung (98). Mit der Entwicklung neuer Technologien im Forschungsbereich der Epilepsien hat sich die Entschlüsselung zugrundeliegender Pathomechanismen der Epileptogenese kontinuierlich verbessert. Der Einsatz von Tiermodellen der Epilepsie und der traumatischen Hirnverletzung ist von großer Bedeutung für die Entdeckung von Biomarkern und potenziellen therapeutischen Interventionsmöglichkeiten (56). Für diesen Zweck stellen sich spezielle molekulare Zielproteine- und Strukturen mit einer veränderten Expression während einer TBI-induzierten Epileptogenese als aussichtsreich für die Entwicklung anti epileptogener Behandlungsstrategien heraus (98). Durch die Verwendung unserer etablierten Tiermodelle der traumatischen Hirnverletzung und in vitro Epilepsie konnten wir neue Einblicke in die Regulation des mit GABAA Rezeptoren-interagierenden Proteins Ubiquilin-1 gewinnen. Neuere Studien haben eine ausgeprägte Regulation der Expression von Ubiquilin-1 in Epilepsien (64), ischämischen Hirnschädigungen (121), sowie in neurodegenerativen Erkrankungen wie Morbus Alzheimer und Morbus Huntington belegt (118, 120). In einem früheren Projekt wurde ein quantitativer Ansatz der Proteom-analyse von isolierten GFP positiven Interneuronen der kontralateralen Hemisphäre nach unilateraler Induktion einer traumatischen Hirnverletzung umgesetzt, um mögliche Zielproteine zu identifizieren, die an posttraumatischen Mechanismen beteiligt sind. Die markierungsfreie Quantifizierung in kortikalen GABAergen Interneuronen von CCI-behandelten GAD67-GFP Mäusen zeigte eine signifikante Herunterregulierung der Ubiquilin-1 Expression 24 Stunden nach Läsionsinduktion. Um gemeinsame Merkmale zwischen der Regulation nach traumatischer Hirnverletzung und Epilepsien zu ermitteln, haben wir ein Epilepsiemodell umgesetzt, um die Ubiquilin-1 Expression in Hirnschnitten des Kortex und Hippocampus zu messen. In der vorliegenden Studie wurde epileptiforme Aktivität in vitro durch das Applizieren einer Kombination aus Kainat (KA, 500 nM) und dem GABAA Rezeptor Antagonisten Picrotoxin - 83 - (PTX, 50 μM) ausgelöst. Diese Chemokonvulsiva wurden bereits zuvor als ein bewährtes in vitro Epilepsiemodell von Ridler et al. etabliert (170). Das repetitive Auftreten der epileptiformen Ereignisse in der hippokampalen CA1 Region von akuten Hirnschnitten haben wir mithilfe von Multielektrodenarrays (MEA) aufgezeichnet. Nach der Induktion epileptiformer Aktivität haben wir die Expression unseres Zielproteins Ubiquilin-1 in einem Zeitfenster von bis zu sieben Stunden nach Anfallsinduktion in kortikalen und hippokampalen Hirnschnitten mithilfe von Western Blots quantifiziert. Hier konnten wir eine signifikante Reduktion der Ubiquilin-1 Expression zu allen Inkubationszeitpunkten feststellen, sowohl im Kortex als auch im Hippocampus. Als nächstes konnten wir die zuvor verminderten Ubiquilin-1 Levels erfolgreich wiederherstellen unter Zuhilfenahme des nicht-selektiven Monoaminooxidase Hemmers Nialamide (NM,10 μM). Unsere Western Blot Daten ließen die Frage aufkommen, ob solch eine Hochregulation der Ubiquilin-1 Expression auch die Eigenschaften der epileptiformen Aktivität in vitro verändern würde. Daher haben wir Dosis Wirkungsbeziehungen gemessen, indem wir steigende PTX-Konzentrationen (0-100 μM) appliziert haben. Bemerkenswerterweise hat die Anwendung von NM während der MEA Aufzeichnungen die epileptiforme Aktivität substanziell abgeschwächt im Hinblick auf die Anzahl der epileptiformen Events und der mittleren Maximalamplitude. Unsere Beobachtungen deuten darauf hin, dass neben einer wiederhergestellten Ubiquilin-1 Expression auch die verschiedenen Systeme der Monoaminen Neurotransmitter zu dem antiepileptischen Effekt beitragen und ein großes Potenzial für zukünftige Studien besitzen.