Regulation der Genexpression des humanen kationischen Aminosäuretransporters hCAT-1
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Der humane kationische Aminosäuretransporter hCAT-1 (SLC7A1) repräsentiert in den meisten Säugerzellen den Hauptaufnahmeweg für die kationischen Aminosäuren L-Arginin, L-Lysin und L-Ornithin. Diese werden für die Proteinbiosynthese und/oder andere wichtige Stoffwechselwege wie Stickstoffmonoxid-Produktion, Polyamin-, Agmatin- Kreatin- und Harnstoffsynthese sowie die Synthese der Aminosäuren Prolin und Glutamin benötigt. Insbesondere L-Arginin ist essentiell für die Proliferation, Zytokinproduktion und somit für die effiziente Funktion von T-Lymphozyten.
Aufgrund der Wichtigkeit von hCAT-1 für das humane Immunsystem und der Tatsache, dass die hCAT-1-Expression in T-Zellen unter Stimulation auf mRNA- wie auch auf Proteinebene stark ansteigt, war das Ziel dieser Arbeit, die bei der Induktion zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären. Zudem sollte herausgefunden werden, welche regulatorischen Elemente an der Expressionsinduktion des Transporters in stimulierten primären humanen T-Lymphozyten beteiligt sind.
Da die hCAT-1-Induktion mit großer Wahrscheinlichkeit vor allem auf eine gesteigerte Transkription zurückzuführen ist, wurde der Promotor von hCAT-1 untersucht. Dabei stellte sich in Luciferase-Reportergen-Analysen heraus, dass sich dieser nicht, wie bisher vermutet, 5’-flankierend von dem Exon 1 von hCAT-1 befindet. Eine Datenbankanalyse gab den Hinweis darauf, dass der Promotor in einem Bereich am Übergang von Exon 1 nach Intron 1 des hCAT-1-Gens lokalisiert sein könnte. Über weitere Luciferase-Reportergen-Analysen konnte in dieser Region tatsächlich eine starke Promotoraktivität nachgewiesen werden. In den nachfolgenden experimentellen Versuchen wurde über zahlreiche 5’- und 3’-Deletionen der Bereich, in dem sich der Kernpromotor befindet, auf einen Abschnitt von 365 bp im Exon 1 und Intron 1 des Gens eingegrenzt. Dieser liegt mit 78 bp im Exon 1 und mit 287 bp im Intron 1. Somit besitzt hCAT-1 einen geninternen Promotor. Des Weiteren besitzt der Kernpromotor von hCAT-1 keine offensichtlichen TATA-Box-Sequenzen, weshalb vermutet wird, dass dieser über andere Promotorelemente reguliert wird, wie z.B. die Bindung von SP1 an GC-reiche Sequenzen. Das Gen von hCAT-1 hat mit hoher Wahrscheinlichkeit, wie auch der Großteil der TATA-Box-losen Promotoren, mehrere Transkriptionsstarts. Dies könnte erklären, warum der Nachweis eines definierten Transkriptionsstarts über RNase-Verdauungsschutz-Analysen nicht gelang. Durch gezielte Inhibition einzelner Signalwege in primären humanen T-Zellen, die bei der Aktivierung der Immunzellen eine entscheidende Rolle spielen, konnte der Transkriptionsfaktor NF-κB als positiver Regulator von hCAT-1 identifiziert werden. Zudem wurde eine NF-κB-Bindestelle in dem Bereich, in dem sich der Kernpromotor befindet, funktionell nachgewiesen, was beweist, dass der Transkriptionsfaktor direkt an die genomische DNA von hCAT-1 bindet und somit die Expression aktivieren könnte. Da die Mutation einer einzelnen NF-κB-Bindestelle nicht zu einem vollständigen Verlust der Promotoraktivität führte und auch die Inhibition von NF-κB in T-Zellen nicht eine komplette Auslöschung der endogenen hCAT-1-mRNA-Expression bewirkte, muss der Transkriptionsfaktor entweder an mehreren Stellen im Gen binden, um die Transkription zu aktivieren, oder es müssen weitere Transkriptionsfaktoren daran beteiligt sein, die in Verbindung mit NF-κB die hCAT-1-Expression an-schalten.