Authors:	Muther, Susanne Katharina
Title:	Regulation der Genexpression des humanen kationischen Aminosäuretransporters hCAT-1
Online publication date:	20-May-2017
Year of first publication:	2017
Language:	german
Abstract:	Der humane kationische Aminosäuretransporter hCAT-1 (SLC7A1) repräsentiert in den meisten Säugerzellen den Hauptaufnahmeweg für die kationischen Aminosäuren L-Arginin, L-Lysin und L-Ornithin. Diese werden für die Proteinbiosynthese und/oder andere wichtige Stoffwechselwege wie Stickstoffmonoxid-Produktion, Polyamin-, Agmatin- Kreatin- und Harnstoffsynthese sowie die Synthese der Aminosäuren Prolin und Glutamin benötigt. Insbesondere L-Arginin ist essentiell für die Proliferation, Zytokinproduktion und somit für die effiziente Funktion von T-Lymphozyten. Aufgrund der Wichtigkeit von hCAT-1 für das humane Immunsystem und der Tatsache, dass die hCAT-1-Expression in T-Zellen unter Stimulation auf mRNA- wie auch auf Proteinebene stark ansteigt, war das Ziel dieser Arbeit, die bei der Induktion zugrundeliegenden Mechanismen aufzuklären. Zudem sollte herausgefunden werden, welche regulatorischen Elemente an der Expressionsinduktion des Transporters in stimulierten primären humanen T-Lymphozyten beteiligt sind. Da die hCAT-1-Induktion mit großer Wahrscheinlichkeit vor allem auf eine gesteigerte Transkription zurückzuführen ist, wurde der Promotor von hCAT-1 untersucht. Dabei stellte sich in Luciferase-Reportergen-Analysen heraus, dass sich dieser nicht, wie bisher vermutet, 5’-flankierend von dem Exon 1 von hCAT-1 befindet. Eine Datenbankanalyse gab den Hinweis darauf, dass der Promotor in einem Bereich am Übergang von Exon 1 nach Intron 1 des hCAT-1-Gens lokalisiert sein könnte. Über weitere Luciferase-Reportergen-Analysen konnte in dieser Region tatsächlich eine starke Promotoraktivität nachgewiesen werden. In den nachfolgenden experimentellen Versuchen wurde über zahlreiche 5’- und 3’-Deletionen der Bereich, in dem sich der Kernpromotor befindet, auf einen Abschnitt von 365 bp im Exon 1 und Intron 1 des Gens eingegrenzt. Dieser liegt mit 78 bp im Exon 1 und mit 287 bp im Intron 1. Somit besitzt hCAT-1 einen geninternen Promotor. Des Weiteren besitzt der Kernpromotor von hCAT-1 keine offensichtlichen TATA-Box-Sequenzen, weshalb vermutet wird, dass dieser über andere Promotorelemente reguliert wird, wie z.B. die Bindung von SP1 an GC-reiche Sequenzen. Das Gen von hCAT-1 hat mit hoher Wahrscheinlichkeit, wie auch der Großteil der TATA-Box-losen Promotoren, mehrere Transkriptionsstarts. Dies könnte erklären, warum der Nachweis eines definierten Transkriptionsstarts über RNase-Verdauungsschutz-Analysen nicht gelang. Durch gezielte Inhibition einzelner Signalwege in primären humanen T-Zellen, die bei der Aktivierung der Immunzellen eine entscheidende Rolle spielen, konnte der Transkriptionsfaktor NF-κB als positiver Regulator von hCAT-1 identifiziert werden. Zudem wurde eine NF-κB-Bindestelle in dem Bereich, in dem sich der Kernpromotor befindet, funktionell nachgewiesen, was beweist, dass der Transkriptionsfaktor direkt an die genomische DNA von hCAT-1 bindet und somit die Expression aktivieren könnte. Da die Mutation einer einzelnen NF-κB-Bindestelle nicht zu einem vollständigen Verlust der Promotoraktivität führte und auch die Inhibition von NF-κB in T-Zellen nicht eine komplette Auslöschung der endogenen hCAT-1-mRNA-Expression bewirkte, muss der Transkriptionsfaktor entweder an mehreren Stellen im Gen binden, um die Transkription zu aktivieren, oder es müssen weitere Transkriptionsfaktoren daran beteiligt sein, die in Verbindung mit NF-κB die hCAT-1-Expression an-schalten. The human cationic amino acid transporter hCAT-1 (SLC7A1) represents the main uptake route for the cationic amino acids L-arginine, L-lysine and L-ornithine in most mammalian cells. These amino acids are required for protein biosynthesis or/and other important metabolic pathways such as nitric oxide production, polyamine, agmatine, creatine and urea synthesis, as well as the synthesis of the amino acids proline and glutamine. In particular, L-arginine is essential for proliferation, cytokine production and thus for the efficient function of human T lymphocytes. Due to the importance of hCAT-1 for the human immune system and the fact that hCAT-1 expression in T cells is strongly stimulated on mRNA and protein levels, the aim of this work was to elucidate the mechanisms underlying the hCAT-1 induction. In particular, the regulatory elements involved in the expression induction of the transporter in stimulated primary human T lymphocytes should be determined. As increased transcription is presumably mainly responsible for hCAT-1 induction, the core promoter of hCAT-1 was investigated. It was found using luciferase reporter gene assays that it is not located in the 5'-flanking region of the exon 1 of hCAT-1 as hitherto presumed. A database analysis indicated that the core promoter might be located in a region at the transition from exon 1 to intron 1 of the hCAT-1 gene. Applying further luciferase reporter gene assays, a strong promoter activity could be detected in this region. In subsequent experiments the range in which the core promoter is located was narrowed down to a section of 365 bp in the exon 1 and intron 1 of the gene via numerous 3 'and 5' deletions with 78 bp in the exon 1 and at 287 bp in the intron 1. Thus, hCAT-1 has a gene-internal promoter. In addition, the core promoter of hCAT-1 does not have any obvious TATA-box sequences, why it is suspected that it is regulated for example via SP1. The gene of hCAT-1 presumably has several transcriptional start sites, as most of the TATA-box-less promotors. This could explain why the detection of a defined transcriptional start site could not be achieved by RNase protection analyzes. The transcription factor NF-κB could be identified as a positive regulator of hCAT-1 by targeted inhibition of single signaling pathways in primary human T cells, which play a decisive role in the activation of immune cells. Furthermore, a putative binding sequence of NF-κB was detected in the region in which the core promoter is located, which indicates that the transcription factor binds directly to the genomic DNA of hCAT-1 and thus could activates its expression. However, it was also shown that mutation of a single NF-κB binding site does not lead to a complete loss of promoter activity and the inhibition of NF-κB in T-cells did not result in a full decrease of endogenous hCAT-1 mRNA expression indicating binding of NF-κB at several sites in the gene or involvement of further transcription factors that activate hCAT-1 expression in cooperation with NF-κB.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-839
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000013159
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	xvii, 130 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen