Charakterisierung verschiedener monoklonaler Antikörper zur Immunodetektion der Metalloprotease Meprin β im Gehirn

Abstract

Die Alzheimer Erkrankung stellt nach wie vor eine Herausforderung für den klinischen Alltag und die Grundlagenforschung dar. Die neurodegenerative Erkrankung, welche zur Gruppe der Amyloidosen gezählt wird, entwickelt sich durch die Ablagerung intracerebraler Plagues im Gehirn, bestehend aus dem Amyloid beta (Aβ). Für deren Entstehung bietet die Amyloid Hypothese nach Selkoe einen Erklärungsansatz (Selkoe und Hardy 2016). Bis heute ist kein kurativer Therapieansatz bekannt. Es ist bekannt, dass die β-Sekretase BACE1 Aβ aus dem Amyloid-Precursor-Protein (APP) am N-terminalen Ende herausschneidet und damit ursächlich für die Bildung der Aβ-Spezies mit einer Länge von 1-40 (Aβ 1-40) Aminosäuren ist. Es zeigte sich jedoch, dass neben der, durch BACE1 gebildeten, Aβ-Molekülen noch andere Aβ-Spezies, beginnend mit Alanin an der zweiten Stelle (Aβ 2-40), im Liquor von Alzheimerpatienten gefunden werden konnten, deren Entstehung nicht auf die Aktivität von BACE1 zurückzuführen ist. Es konnte gezeigt werden, dass die Metalloprotease Meprin β nicht nur eine alternative Beta-Sekretase für APP darstellt (Becker-Pauly und Pietrzik 2016), sondern auch, dass sie für die Bildung von Aβ (2 40/42) verantwortlich ist, sowie Aβ (1-40) zu generieren (Bien et al. 2012). Da Meprin β in der Lage ist Aβ (2-40/42) aus APP zu generieren, liegt die Vermutung nah, dass die Zinkprotease auch eine Rolle in der Pathogenese der Alzheimer Erkrankung spielt. Vorherige Untersuchungen belegen eine Expression von Meprin β auf mRNA Ebene im Gehirn (Bien et al. 2012). Ein direkter Nachweis des Proteins mithilfe eines monoklonalen Antikörpers in der Immunfluoreszenz gelang bisweilen jedoch nicht. Um Meprin β im Gehirn nachweisen zu können, wurden mit Hilfe von Professor Doktor Carsten Korth von der Universität Düsseldorf, monoklonale Antikörper aus Hybridoma Einzelzellklonen. Deren Funktionalität, in Bezug auf die spezifische Bindung an Meprin β, zeigte sich bei einigen Einzelzellklonen in der Zellkultur (Nancy Uhlig 2013b). Ziel der Promotionsarbeit ist es die Fähigkeit dieser monoklonalen Antikörper zur Detektion von Meprin β im Gehirn zu untersuchen. Hierfür werden Gewebelysate von Hirn und Niere, wobei die Niere eine hohe Expression von Meprin β aufweist und sich damit zur Positivkontrolle eignet, aus Wildtyp Mäusen und Knock-out Mäusen für Meprin β in der Gelelektrophorese aufgeteilt und mithilfe des Nassblotverfahrens auf einer Membran fixiert. Die Membran wird dann mit dem zu untersuchenden Antikörper inkubiert und sein Bindungsverhalten durch Immunfluoreszenz sichtbar gemacht. Als weitere Kontrollgruppe werden zusätzlich transient transfizierte HEK293T mit einer Überexpression von Meprin β und rekombinant hergestelltes Meprin β demselben Untersuchungsprozess unterzogen, da hier sicher davon ausgegangen werden kann, dass Meprin β in einer hohen Konzentration vorliegt. Ein immunologischer Nachweis von Meprin β im Gehirn ermöglicht nicht nur den definitiven Beweis für das Vorhandensein des Enzyms im Gehirn, sondern kann der erste Schritt in Richtung einer zielgerichteten Therapie der Alzheimer Erkrankung darstellen, sofern diese monoklonalen Antikörper in der Lage wären, die Metalloprotease Meprin β zu inaktivieren.