Charakterisierung verschiedener monoklonaler Antikörper zur Immunodetektion der Metalloprotease Meprin β im Gehirn
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Abstract
Die Alzheimer Erkrankung stellt nach wie vor eine Herausforderung für den
klinischen Alltag und die Grundlagenforschung dar.
Die neurodegenerative Erkrankung, welche zur Gruppe der Amyloidosen gezählt
wird, entwickelt sich durch die Ablagerung intracerebraler Plagues im Gehirn,
bestehend aus dem Amyloid beta (Aβ). Für deren Entstehung bietet die Amyloid
Hypothese nach Selkoe einen Erklärungsansatz (Selkoe und Hardy 2016). Bis heute
ist kein kurativer Therapieansatz bekannt.
Es ist bekannt, dass die β-Sekretase BACE1 Aβ aus dem Amyloid-Precursor-Protein
(APP) am N-terminalen Ende herausschneidet und damit ursächlich für die Bildung
der Aβ-Spezies mit einer Länge von 1-40 (Aβ 1-40) Aminosäuren ist.
Es zeigte sich jedoch, dass neben der, durch BACE1 gebildeten, Aβ-Molekülen noch
andere Aβ-Spezies, beginnend mit Alanin an der zweiten Stelle (Aβ 2-40), im Liquor
von Alzheimerpatienten gefunden werden konnten, deren Entstehung nicht auf die
Aktivität von BACE1 zurückzuführen ist. Es konnte gezeigt werden, dass die
Metalloprotease Meprin β nicht nur eine alternative Beta-Sekretase für APP darstellt
(Becker-Pauly und Pietrzik 2016), sondern auch, dass sie für die Bildung von Aβ (2
40/42) verantwortlich ist, sowie Aβ (1-40) zu generieren (Bien et al. 2012).
Da Meprin β in der Lage ist Aβ (2-40/42) aus APP zu generieren, liegt die Vermutung
nah, dass die Zinkprotease auch eine Rolle in der Pathogenese der Alzheimer
Erkrankung spielt. Vorherige Untersuchungen belegen eine Expression von Meprin β
auf mRNA Ebene im Gehirn (Bien et al. 2012). Ein direkter Nachweis des Proteins
mithilfe eines monoklonalen Antikörpers in der Immunfluoreszenz gelang bisweilen
jedoch nicht.
Um Meprin β im Gehirn nachweisen zu können, wurden mit Hilfe von Professor
Doktor Carsten Korth von der Universität Düsseldorf, monoklonale Antikörper aus
Hybridoma Einzelzellklonen. Deren Funktionalität, in Bezug auf die spezifische
Bindung an Meprin β, zeigte sich bei einigen Einzelzellklonen in der Zellkultur (Nancy
Uhlig 2013b).
Ziel der Promotionsarbeit ist es die Fähigkeit dieser monoklonalen Antikörper zur
Detektion von Meprin β im Gehirn zu untersuchen. Hierfür werden Gewebelysate von
Hirn und Niere, wobei die Niere eine hohe Expression von Meprin β aufweist und
sich damit zur Positivkontrolle eignet, aus Wildtyp Mäusen und Knock-out Mäusen für
Meprin β in der Gelelektrophorese aufgeteilt und mithilfe des Nassblotverfahrens auf
einer Membran fixiert. Die Membran wird dann mit dem zu untersuchenden
Antikörper inkubiert und sein Bindungsverhalten durch Immunfluoreszenz sichtbar
gemacht.
Als weitere Kontrollgruppe werden zusätzlich transient transfizierte HEK293T mit
einer Überexpression von Meprin β und rekombinant hergestelltes Meprin β
demselben Untersuchungsprozess unterzogen, da hier sicher davon ausgegangen
werden kann, dass Meprin β in einer hohen Konzentration vorliegt.
Ein immunologischer Nachweis von Meprin β im Gehirn ermöglicht nicht nur den
definitiven Beweis für das Vorhandensein des Enzyms im Gehirn, sondern kann der
erste Schritt in Richtung einer zielgerichteten Therapie der Alzheimer Erkrankung
darstellen, sofern diese monoklonalen Antikörper in der Lage wären, die
Metalloprotease Meprin β zu inaktivieren.