Entwicklung von neuen Testsystemen zur Identifizierung von resistenzbrechenden antibiotisch aktiven Naturstoffen
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In dieser Arbeit sollten Testsysteme zur Identifizierung von resistenzbrechenden antibiotisch aktiven Naturstoffen entwickelt werden. Die Testsysteme sollten dabei auf Toxin-Antitoxin Systemen basieren, da diese häufig auf Resistenzplasmiden zu finden sind und dort eine Stabilisierung des Plasmids vermitteln. Als Toxin-Antitoxin System wurde das System MazEF gewählt, da dieses zum einen weit verbreitet und zum anderen bereits gut erforscht ist. Dabei sollte die RNAse Aktivität von MazF genutzt werden. Das erste Testsystem sollte in vitro mit Hilfe von gereinigtem MazE und MazF als proximity-Assay entwickelt werden und eine störfaktorfreie Umgebung zur Untersuchung von Substanzen schaffen. Das zweite Testsystem sollte in vivo die natürliche Situation von MazEF stabilisierten Resistenzplasmiden in E. coli nachstellen. Die Detektion einer aktiven Substanz sollte hierbei durch die Expression einer Luciferase und einer dadurch nachgehend detektierbaren Lumineszenz bei Substratzugabe geschehen. Mit Hilfe des Counterscreens zum in vivo Test sollten außerdem Substanzen mit biologischer Aktivität gegen E. coli identifiziert werden. In einem weiteren Experiment sollte außerdem das entwickelte in vivo Testsystem auf das Toxin-Antitoxin System EndoAIA aus Bacillus subtilis übertragen werden, um zu zeigen, dass das Testverfahren auch mit anderen Toxin-Antitoxin Systemen funktioniert.
Mit Hilfe dieser Testsysteme sollte die Extraktesammlung des IBWF getestet werden und die zugehörigen Pilze der positiven Treffer nachfermentiert werden. Aus den daraus gewonnenen Rohextrakten sollten die aktiven Substanzen isoliert und in biologischen Assays charakterisiert, sowie die Struktur aufgeklärt werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde das für die Entwicklung des in vitro Tests nötige MazF erfolgreich exprimiert und gereinigt. Das benötigte MazE konnte ebenfalls exprimiert und teilweise gereinigt werden. Die Funktionalität der Komponenten konnte durch einen Oligonukleotidtest gezeigt werden.
In einem zweiten Teil wurde ein in vivo Test erfolgreich entwickelt und angewandt. Das dafür benötigte Markerenzymplasmid wurde konstruiert und zusammen mit einem Plasmid zur MazEF Expression in E. coli transformiert. Die Testparameter wie der Assaypuffer, die Inkubationsbedingungen, die Zelldichte, der Lysepuffer und das Substrat konnten etabliert und optimiert werden.
Es wurden mit Hilfe des in vivo Tests die Extrakte von 1300 Pilzen auf Aktivität gegen das Toxin-Antitoxin System MazEF sowie gegen E. coli untersucht. Dabei wurden vier Substanzen isoliert.
Die aus Hypholoma tuberosum IBWF12066 isolierte Zielsubstanz zeigte auch in Reinform bei einer Konzentration von 5 µg/ml Aktivität gegen E. coli. Des Weiteren zeigte diese Substanz in der biologischen Charakterisierung starke antifungische und antibakterielle Aktivität sowie gegen M. grisea, B. cinerea und P. infestans.
Die aus Psathyrella conopilus IBWF12013 isolierte Zielsubstanz CK 12013-1 ist bisher noch nicht in der Literatur beschrieben. Es handelt sich um ein Polyin mit einer Säuregruppe. Die Substanz zeigte keine Aktivität gegen E. coli, jedoch 100 % Aktivität gegen HeLa3-Zellen bei einer Konzentration von 50 µg/ml..
Aus Wallemia muriae IBWF15001 wurde zum einen die Zielsubstanz Atromentin CK 15001-1 isoliert, welches als Reinsubstanz keine biologische Aktivität zeigte. Die Substanz stellt in Basidiomyceten ein wichtiges Stoffwechselzwischenprodukt dar. Des Weiteren wurde die Substanz CK 15001-2, ein Derivat von Atromentin, isoliert. Die Substanz zeigte ebenfalls keine Aktivität gegen E. coli, jedoch 100 % Aktivität gegen HeLa3-Zellen bei einer Konzentration von 5 µg/ml.