Authors:	Kübler, Corinna
Title:	Entwicklung von neuen Testsystemen zur Identifizierung von resistenzbrechenden antibiotisch aktiven Naturstoffen
Online publication date:	31-Jan-2018
Year of first publication:	2018
Language:	german
Abstract:	In dieser Arbeit sollten Testsysteme zur Identifizierung von resistenzbrechenden antibiotisch aktiven Naturstoffen entwickelt werden. Die Testsysteme sollten dabei auf Toxin-Antitoxin Systemen basieren, da diese häufig auf Resistenzplasmiden zu finden sind und dort eine Stabilisierung des Plasmids vermitteln. Als Toxin-Antitoxin System wurde das System MazEF gewählt, da dieses zum einen weit verbreitet und zum anderen bereits gut erforscht ist. Dabei sollte die RNAse Aktivität von MazF genutzt werden. Das erste Testsystem sollte in vitro mit Hilfe von gereinigtem MazE und MazF als proximity-Assay entwickelt werden und eine störfaktorfreie Umgebung zur Untersuchung von Substanzen schaffen. Das zweite Testsystem sollte in vivo die natürliche Situation von MazEF stabilisierten Resistenzplasmiden in E. coli nachstellen. Die Detektion einer aktiven Substanz sollte hierbei durch die Expression einer Luciferase und einer dadurch nachgehend detektierbaren Lumineszenz bei Substratzugabe geschehen. Mit Hilfe des Counterscreens zum in vivo Test sollten außerdem Substanzen mit biologischer Aktivität gegen E. coli identifiziert werden. In einem weiteren Experiment sollte außerdem das entwickelte in vivo Testsystem auf das Toxin-Antitoxin System EndoAIA aus Bacillus subtilis übertragen werden, um zu zeigen, dass das Testverfahren auch mit anderen Toxin-Antitoxin Systemen funktioniert. Mit Hilfe dieser Testsysteme sollte die Extraktesammlung des IBWF getestet werden und die zugehörigen Pilze der positiven Treffer nachfermentiert werden. Aus den daraus gewonnenen Rohextrakten sollten die aktiven Substanzen isoliert und in biologischen Assays charakterisiert, sowie die Struktur aufgeklärt werden. In der vorliegenden Arbeit wurde das für die Entwicklung des in vitro Tests nötige MazF erfolgreich exprimiert und gereinigt. Das benötigte MazE konnte ebenfalls exprimiert und teilweise gereinigt werden. Die Funktionalität der Komponenten konnte durch einen Oligonukleotidtest gezeigt werden. In einem zweiten Teil wurde ein in vivo Test erfolgreich entwickelt und angewandt. Das dafür benötigte Markerenzymplasmid wurde konstruiert und zusammen mit einem Plasmid zur MazEF Expression in E. coli transformiert. Die Testparameter wie der Assaypuffer, die Inkubationsbedingungen, die Zelldichte, der Lysepuffer und das Substrat konnten etabliert und optimiert werden. Es wurden mit Hilfe des in vivo Tests die Extrakte von 1300 Pilzen auf Aktivität gegen das Toxin-Antitoxin System MazEF sowie gegen E. coli untersucht. Dabei wurden vier Substanzen isoliert. Die aus Hypholoma tuberosum IBWF12066 isolierte Zielsubstanz zeigte auch in Reinform bei einer Konzentration von 5 µg/ml Aktivität gegen E. coli. Des Weiteren zeigte diese Substanz in der biologischen Charakterisierung starke antifungische und antibakterielle Aktivität sowie gegen M. grisea, B. cinerea und P. infestans. Die aus Psathyrella conopilus IBWF12013 isolierte Zielsubstanz CK 12013-1 ist bisher noch nicht in der Literatur beschrieben. Es handelt sich um ein Polyin mit einer Säuregruppe. Die Substanz zeigte keine Aktivität gegen E. coli, jedoch 100 % Aktivität gegen HeLa3-Zellen bei einer Konzentration von 50 µg/ml.. Aus Wallemia muriae IBWF15001 wurde zum einen die Zielsubstanz Atromentin CK 15001-1 isoliert, welches als Reinsubstanz keine biologische Aktivität zeigte. Die Substanz stellt in Basidiomyceten ein wichtiges Stoffwechselzwischenprodukt dar. Des Weiteren wurde die Substanz CK 15001-2, ein Derivat von Atromentin, isoliert. Die Substanz zeigte ebenfalls keine Aktivität gegen E. coli, jedoch 100 % Aktivität gegen HeLa3-Zellen bei einer Konzentration von 5 µg/ml. In this work, test systems for the identification of resistance-preventing antibiotically active natural substances were to be developed. The test systems should be based on toxin-antitoxin systems, as these are often found on resistance plasmids and provide stabilisation of the plasmid. The MazEF system was chosen as the toxin-antitoxin system because it is widely used and has already been well researched. The RNAse activity of MazF should be used. The first test system was to be developed in vitro using purified MazE and MazF as proximity assay and to create a disturbance-free environment for the investigation of substances. The second test system was to simulate in vivo the natural situation of MazEF stabilized resistance plasmids in E. coli. The detection of an active substance should be carried out by the expression of a luciferase and a subsequently detectable luminescence when the substrate is added. The counterscreen for the in vivo test was also used to identify substances with biological activity against E. coli. In a further experiment, the in vivo test system developed was to be transferred to the toxin-antitoxin system EndoAIA from Bacillus subtilis in order to show that the test procedure also works with other toxin-antitoxin systems. With the help of these test systems, the IBWF's extract collection should be tested and the associated fungi of the positive results should be subsequently fermented. The active substances were to be isolated from the raw extracts obtained from these raw materials and characterized in biological assays and the structure was to be elucidated. In this paper, the MazF necessary for the development of the in vitro test was successfully expressed and purified. The required MazE could also be expressed and partially cleaned. The functionality of the components could be demonstrated by an oligonucleotide test. In a second part, an in vivo test was successfully developed and applied. The marker enzyme plasmid required for this purpose was constructed and transformed into E. coli together with a plasmid for MazEF expression. The test parameters such as the assay buffer, incubation conditions, cell density, lysis buffer and substrate were established and optimized. The extracts of 1300 fungi were tested in vivo for activity against the toxin-antitoxin system MazEF and E. coli. Four substances were isolated. The target substance isolated from Hypholoma tuberosum IBWF12066 also showed activity against E. coli in pure form at a concentration of 5 µg/ml. Furthermore, this substance showed strong antifungal and antibacterial activity in the biological characterization as well as against M. grisea, B. cinerea and P. infestans. The target substance CK 12013-1, isolated from Psathyrella conopilus IBWF12013, has not yet been described in the literature. It is a polyine with an acid group. The substance showed no activity against E. coli, but 100% activity against HeLa3 cells at a concentration of 50 µg/ml. The target substance atromentin CK 15001-1 was isolated from Wallemia muriae IBWF15001, which showed no biological activity as a pure substance. The substance is an important metabolic intermediate in basidiomycetes. Furthermore, the substance CK 15001-2, a derivative of atromentin, was isolated. The substance also showed no activity against E. coli, but 100% activity against HeLa3 cells at a concentration of 5 µg/ml.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-2842
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000018889
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	127 Blätter
Appears in collections:	JGU-Publikationen