Subletale Schädigung von Mikroorganismen – Entwicklung von Schädigungsprotokollen für den Einsatz in der Validierung und Evaluierung der Schädigung auf Basis zellulärer und molekularer Methoden
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Humanpathogene Bakterien sind auch in Lebensmitteln zu finden und können bei Verzehr Krankheiten auslösen, weswegen Lebensmittel anhand von vorgeschriebenen ISO-Normen auf pathogene Bakterien hin getestet werden müssen. Lebensmittel können für Bakterien eine stressige Umgebung darstellen und zur Schädigung der bakteriellen Zelle führen. Diese Bakterien können bei Einsatz von selektiven Nährmedien in den Lebensmitteln häufig nicht mehr nachgewiesen werden. Zur Entwicklung von Methoden- oder Nährmedien für den bakteriellen Nachweis sollen möglichst natürlich kontaminierte Lebensmittel verwendet werden, eine artifizielle Kontamination ist jedoch erlaubt. Eine Verwendung von geschädigten Bakterien für die artifizielle Kontamination ist von Vorteil um eine möglichst sensitive Methode zu entwickeln.
In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Schädigung von Bakterien mittels Trocknung in Laktose-Monohydrat und Milchpulver sowie durch Hitze durchgeführt. Verwendet wurden relevante Bakterien für die Lebensmittelindustrie. Die entwickelten Protokolle sollen in zukünftigen Validierungen zur Generierung geschädigter Bakterien eingesetzt werden. Insgesamt zeigte sich, dass die verwendeten Methoden geeignet waren, um gestresste Bakterien zu erzeugen. Einige verwendete Bakterien konnten nur in Milchpulver getrocknet werden, nicht jedoch in Laktose-Monohydrat. Hierzu gehörten Listeria monocytogenes ATCC® 19111, Escherichia coli ATCC® 700728 und Salmonella enterica ser. Enteritidis. Sowohl in Laktose als auch in Milchpulver konnte eine initiale Abnahme der Keimzahl nach der Trocknung beobachtet werden, bevor es zu einer Stabilisierung der Keimzahl kam. In Milchpulver getrocknete Bakterien können über einen längeren Zeitraum mit geringer Abnahme der Keimzahl gelagert werden. In Laktose-Monohydrat dauerte die initiale Abnahme der Keimzahl über mehrere Wochen an, bevor eine Stabilisierung eintrat. Im Vergleich zu Milchpulver nahm die Keimzahl in Laktose-Monohydrat jedoch auch nach der Stabilisierung deutlich schneller ab. Durch eine Lagerung der in Laktose-Monohydrat getrockneten Proben von Salmonella enterica ser. Typhimurium bei 4°C und -20°C konnte die Stabilität der Keimzahl deutlich erhöht werden. Bei der Behandlung durch Hitze konnten ebenfalls geschädigte Bakterien generiert werden, welche für etwa 140 Tage bei -80°C bei relativ stabiler Keimzahl und Schädigungsrate gelagert werden konnten. Die Bakterien befanden sich in Nährbouillon mit 15% Glycerin.
In Laktose getrocknete Salmonella enterica ser. Typhimurium wurden für einen Validierungsversuch mit Milchpulver als Lebensmittel eingesetzt. Die Lebensmittelproben wurden mit verschiedenen Inokulationsstufen beimpft. Zum Vergleich wurde ein zweiter Ansatz mit einer ungestressten Flüssigkultur angeimpft. Es zeigte sich, dass die getrockneten Bakterien in den Untersuchungen ebenso gut nachgewiesen werden konnten wie die ungestressten Bakterien. Somit können sie für zukünftige Validierungsversuche eingesetzt werden.
Durch Trocknung in Laktose-Monohydrat gestresste Salmonella enterica ser. Typhimurium zeigten in Proteomuntersuchungen deutliche Expressionsunterschiede relevanter Proteine zum Schutz der Zelle vor osmotischem Stress, Hungerstress und oxidativem Stress im Vergleich mit ungestressten Bakterien. Es konnten Transporter für Osmoprotektoren, Genregulatoren, Schutzproteine für die DNA sowie Proteine für alternative Stoffwechselwege mit einer höheren Expression detektiert werden. Die Funktion vieler Proteine, die in dieser Arbeit ermitteltet wurden, ist noch nicht bekannt.