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Authors: Lindner, Sabine
Title: Subletale Schädigung von Mikroorganismen – Entwicklung von Schädigungsprotokollen für den Einsatz in der Validierung und Evaluierung der Schädigung auf Basis zellulärer und molekularer Methoden
Online publication date: 24-Oct-2018
Year of first publication: 2018
Language: german
Abstract: Humanpathogene Bakterien sind auch in Lebensmitteln zu finden und können bei Verzehr Krankheiten auslösen, weswegen Lebensmittel anhand von vorgeschriebenen ISO-Normen auf pathogene Bakterien hin getestet werden müssen. Lebensmittel können für Bakterien eine stressige Umgebung darstellen und zur Schädigung der bakteriellen Zelle führen. Diese Bakterien können bei Einsatz von selektiven Nährmedien in den Lebensmitteln häufig nicht mehr nachgewiesen werden. Zur Entwicklung von Methoden- oder Nährmedien für den bakteriellen Nachweis sollen möglichst natürlich kontaminierte Lebensmittel verwendet werden, eine artifizielle Kontamination ist jedoch erlaubt. Eine Verwendung von geschädigten Bakterien für die artifizielle Kontamination ist von Vorteil um eine möglichst sensitive Methode zu entwickeln. In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zur Schädigung von Bakterien mittels Trocknung in Laktose-Monohydrat und Milchpulver sowie durch Hitze durchgeführt. Verwendet wurden relevante Bakterien für die Lebensmittelindustrie. Die entwickelten Protokolle sollen in zukünftigen Validierungen zur Generierung geschädigter Bakterien eingesetzt werden. Insgesamt zeigte sich, dass die verwendeten Methoden geeignet waren, um gestresste Bakterien zu erzeugen. Einige verwendete Bakterien konnten nur in Milchpulver getrocknet werden, nicht jedoch in Laktose-Monohydrat. Hierzu gehörten Listeria monocytogenes ATCC® 19111, Escherichia coli ATCC® 700728 und Salmonella enterica ser. Enteritidis. Sowohl in Laktose als auch in Milchpulver konnte eine initiale Abnahme der Keimzahl nach der Trocknung beobachtet werden, bevor es zu einer Stabilisierung der Keimzahl kam. In Milchpulver getrocknete Bakterien können über einen längeren Zeitraum mit geringer Abnahme der Keimzahl gelagert werden. In Laktose-Monohydrat dauerte die initiale Abnahme der Keimzahl über mehrere Wochen an, bevor eine Stabilisierung eintrat. Im Vergleich zu Milchpulver nahm die Keimzahl in Laktose-Monohydrat jedoch auch nach der Stabilisierung deutlich schneller ab. Durch eine Lagerung der in Laktose-Monohydrat getrockneten Proben von Salmonella enterica ser. Typhimurium bei 4°C und -20°C konnte die Stabilität der Keimzahl deutlich erhöht werden. Bei der Behandlung durch Hitze konnten ebenfalls geschädigte Bakterien generiert werden, welche für etwa 140 Tage bei -80°C bei relativ stabiler Keimzahl und Schädigungsrate gelagert werden konnten. Die Bakterien befanden sich in Nährbouillon mit 15% Glycerin. In Laktose getrocknete Salmonella enterica ser. Typhimurium wurden für einen Validierungsversuch mit Milchpulver als Lebensmittel eingesetzt. Die Lebensmittelproben wurden mit verschiedenen Inokulationsstufen beimpft. Zum Vergleich wurde ein zweiter Ansatz mit einer ungestressten Flüssigkultur angeimpft. Es zeigte sich, dass die getrockneten Bakterien in den Untersuchungen ebenso gut nachgewiesen werden konnten wie die ungestressten Bakterien. Somit können sie für zukünftige Validierungsversuche eingesetzt werden. Durch Trocknung in Laktose-Monohydrat gestresste Salmonella enterica ser. Typhimurium zeigten in Proteomuntersuchungen deutliche Expressionsunterschiede relevanter Proteine zum Schutz der Zelle vor osmotischem Stress, Hungerstress und oxidativem Stress im Vergleich mit ungestressten Bakterien. Es konnten Transporter für Osmoprotektoren, Genregulatoren, Schutzproteine für die DNA sowie Proteine für alternative Stoffwechselwege mit einer höheren Expression detektiert werden. Die Funktion vieler Proteine, die in dieser Arbeit ermitteltet wurden, ist noch nicht bekannt.
Human pathogenic bacteria can also be found in food and can cause diseases when consumed, which is why food must be tested for pathogenic bacteria according to prescribed ISO standards. Food can be a stressful environment for bacteria and lead to damage to the bacterial cell. These bacteria can often no longer be detected when selective nutrient media are used in foods. For the development of methods or culture media for bacterial detection, naturally contaminated food should be used as far as possible, but artificial contamination is permitted. The use of damaged bacteria for artificial contamination is advantageous in order to develop a method that is as sensitive as possible. In the present study, investigations on the damage of bacteria by drying in lactose monohydrate and milk powder as well as by heat were carried out. Relevant bacteria for the food industry were used. The developed protocols will be used in future validations for the generation of damaged bacteria. Overall, it was found that the methods used were suitable to generate stressed bacteria. Some of the bacteria used could only be dried in milk powder, but not in lactose monohydrate. These included Listeria monocytogenes ATCC® 19111, Escherichia coli ATCC® 700728 and Salmonella enterica ser. Enteritidis. Both in lactose and in milk powder, an initial decrease in the bacterial count after drying was observed before the bacterial count was stabilized. Bacteria dried in milk powder can be stored for a longer period of time with a slight decrease in the bacterial count. In lactose monohydrate, the initial decrease in the bacterial count lasted several weeks before stabilisation occurred. Compared to milk powder, however, the bacterial count in lactose monohydrate decreased significantly faster even after stabilization. By storing the samples of Salmonella enterica ser. Typhimurium at 4°C and -20°C, the stability of the bacterial count could be significantly increased. During the treatment by heat also damaged bacteria could be generated, which could be stored for about 140 days at -80°C with a relatively stable bacterial count and damage rate. The bacteria were in nutrient broth with 15% glycerine. Salmonella enterica ser.Typhimurium dried in lactose was used for a validation experiment with milk powder as food. The food samples were inoculated with different amounts of bacteria. For comparison, a second batch was inoculated with an unstressed liquid culture. It was found that the dried bacteria could be detected just as well as the unstressed bacteria. Thus, they can be used for future validation experiments. Salmonella enterica ser.. Typhimurium stressed by drying in lactose monohydrate showed clear differences in the expression of relevant proteins to protect the cell against osmotic stress, starvation stress and oxidative stress compared to unstressed bacteria. Transporters for osmoprotectors, gene regulators, protective proteins for DNA as well as proteins for alternative metabolic pathways with higher expression could be detected. The function of many proteins identified in this work are not yet known.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-1172
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000023480
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: VI, VII, 202 Blätter
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