Biochemical characterization of disease-related alleles of human Telomerase RNA (hTR)

Abstract

Telomere sind die Endbereiche von Chromosomen, die sie vor einem Verfall sowie der Verschmelzung mit anderen Chromosomen schützen. Sie bestehen aus dem sich wiederholenden DNA-Hexamer 5'-GGTTAG-3', dessen Länge beim Menschen 10 bis 15 kbp beträgt, mit 100 bis 200 bps einzelsträngigem 3'-Überhang. Die wichtigste Strategie, um der Telomerverkürzung entgegenzuwirken, die sowohl von Stammzellen als auch von den meisten Tumoren genutzt wird, ist die Aktivität der Telomerase. Die Kernkomponenten der menschlichen Telomerase sind die katalytische Proteinuntereinheit Telomerase Reverse Transcriptase (TERT) und die menschliche Telomerase-RNA (hTR). hTERT ist in der Lage, die endständigen DNA-Sequenzen, die bei der DNA-Replikation während der Zellteilung verloren gehen, durch wiederholte reverse Transkription der in hTR enthaltenen Template-Region auf die Chromosomenenden zu ergänzen. Mutationen in verschiedenen Komponenten der Telomerase, sowie in Faktoren, die an ihrer Biogenese beteiligt sind, wurden bei Patienten mit Telomerbiologie-Störungen (TBDs) festgestellt. Durch die Beeinträchtigung der Telomerasefunktion beschleunigen diese Mutationen die Verkürzung der Telomere, was zu einer Reduktion der Stammzellen in verschiedenen Geweben führt. Das Ziel dieser Arbeit ist es, zu verstehen, wie verschiedene Regionen der hTR die Telomerase-Biogenese und -Aktivität beeinflussen. Zunächst konzentrierte ich mich auf die Untersuchung der 5'-terminalen Region von hTR, die G-reich ist und bekanntermaßen G-Quadruplex-Strukturen (G4) bildet, sowie mit der Helikase DHX36 und den heterogenen nuklearen Ribonukleoproteinen hnRNP H/F interagiert. Unter Ausnutzung von zwei bekannten krankheitsbezogenen Mutationen von hTR in dieser Region, insbesondere der Transversion G>C an Position 2 (G2C) und G>T an Position 11 (G11T), habe ich hauptsächlich die Ansätze der qPCR und der direkten Telomerase-Aktivitäts-Assays (DTAAs) verwendet, um die Bedeutung dieser Region für die hTR-Expression und Telomerase-Aktivität zu testen. Darüber hinaus untersuchte ich die Beteiligung von DHX36 und hnRNP H1 (eines der hnRNP H/F-Proteine, die mit hTR interagieren) an denselben Prozessen durch Depletion und Überexpression dieser Proteine in Zellen, die entweder Wildtyp (WT) oder mutierte hTR exprimieren. Insgesamt konnte ich zeigen, dass beide hTR-Mutationen die Telomerase-Aktivität verringern, ohne die Telomerase-Prozessivität zu beeinträchtigen, und dass sie im Vergleich zu WT-hTR auf einem ähnlichen Niveau exprimiert werden. Auch die Deletion von DHX36 selbst senkt die Telomeraseaktivität und zeigt eine additive Wirkung auf die Expression beider hTR-Mutanten. Umgekehrt erhöht die Reduktion/Depletion von hnRNP H1 die Telomeraseaktivität, während seine Überexpression die mit DTAA nachgewiesene Produktakkumulation verringert. Im zweiten Teil meiner Dissertation charakterisierte ich zwei Mutationen in der hTR-Template-Region, die Substitutionen A>G an Position 48 (A48G) und C>A an Position 50 (C50A) unter Verwendung der zuvor erwähnten Ansätze. Beide Mutanten zeigen eine stark verringerte Prozessivität der Telomerase, werden aber im Vergleich zu WT-hTR in ähnlichem Maße exprimiert. Nach weiterer Charakterisierung der C50A-hTR-Mutante zeigen meine Ergebnisse, dass die Template-Mutationen die Telomererhaltung auf verschiedene Weise beeinflussen. Erstens verursachen sie im mutierten Enzym eine Verschiebung von Translokation zu Dissoziation. Zweitens ist die Verlängerungsaktivität der WT-Telomerase beeinträchtigt, sobald mutierte Wiederholungen am Ende eines Telomers vorhanden sind. Drittens ist es wahrscheinlich, dass der Einbau der mutierten Wiederholungen in die Telomere die Wechselwirkungen mit Telomer-bindenden Proteinen und dadurch die Schutzfunktion von Shelterin beeinträchtigt. Abschließend begann ich mit der Charakterisierung von Fibroblastenzellen, die von einem Patienten mit Dyskeratosis Congenita isoliert wurden, der die Mutation C50A-hTR und eine weitere Miss-Sense-Mutation im RTEL1-Gen (ebenfalls an der Telomererhaltung beteiligt) in Heterozygotie trägt. Ich konnte zeigen, dass die Fibroblasten des Patienten ein beeinträchtigtes Zellwachstum aufweisen, was eher auf eine beschleunigte Seneszenz der Zellen als auf einen erhöhten Zelltod zurückzuführen ist.

Telomeres are the terminal regions of chromosomes that protect chromosome ends from deterioration and fusion with other chromosomes. They are composed of the repetitive DNA hexamer 5'-GGTTAG-3‘, with a length that in human spans from 10 to 15 kbp, with 100 to 200 bps of single-stranded 3’ overhang. The main strategy to counteract telomere shortening used by both stem cells and the majority of tumors, is through the activity of telomerase. The core components of human telomerase are the catalytic protein subunit Telomerase Reverse Transcriptase (TERT) and the human Telomerase RNA (hTR). hTERT is able to replenish the terminal DNA sequences lost upon DNA replication during cell division, by repeatedly reverse transcribing the template region contained in hTR onto the chromosome ends. Mutations in different components of telomerase as well as in factors participating in its biogenesis have been identified in patients affected by Telomere Biology Disorders (TBDs). By interfering with telomerase function, these mutations accelerate telomere shortening leading to the depletion of stem cells in various tissues. The aim of this thesis is to understand how different regions of hTR affect telomerase biogenesis and activity. At first, I focused on studying the very 5’ terminal region of hTR, which is G-rich, known to form G-quadruplex structures (G4), and to interact with the helicase DHX36 and the heterogeneous nuclear ribonucleoproteins hnRNP H/F. Taking advantage of two reported disease-related mutations of hTR within this region, specifically the transversion G>C at position 2 (G2C) and G>T at position 11 (G11T), I mainly used the approaches of qPCR and Direct Telomerase Activity Assays (DTAAs) to test the relevance of this region to hTR expression and telomerase activity. Additionally, I studied the involvement of DHX36 and hnRNP H1 (one of the hnRNP H/F proteins interacting with hTR) to the same processes thanks to depletion and overexpression of those proteins in cells expressing either wild-type (WT) or mutant hTR. Altogether, I showed that both mutations of hTR reduce telomerase activity without affecting telomerase processivity, and are expressed at a similar level compared to WT-hTR. Similarly, DHX36 depletion by itself lowers telomerase activity and displays an additive effect upon either mutant hTR expression. Conversely, hnRNP H1 depletion increases telomerase activity, while its overexpression reduces the product accumulation detected by DTAA. In the second part of my thesis, I characterized two mutations within the template region of hTR, namely the substitutions A>G at position 48 (A48G) and C>A at position 50 (C50A), using the same approaches applied previously. Both mutants display a severe reduction in processivity of telomerase, besides being expressed at a similar level compared to WT-hTR. After further characterization of the mutant C50A-hTR, my results reveal that template mutations affect telomere maintenance in multiple ways. Firstly, they cause a shift from translocation to dissociation in the mutant enzyme. Secondly, once mutant telomeric repeats are present at the terminus of a telomere, elongation activity of WT telomerase is impaired. Thirdly, it is likely that incorporating mutant repeats into the telomeres affects the interactions with telomere binding proteins thereby compromising the protective function of shelterin. Finally, I began the characterization of fibroblasts cells isolated from a patient affected by Dyskeratosis Congenita who is carrying the mutation C50A-hTR and another miss-sense mutation in the RTEL1 gene (also involved in telomere maintenance), both in heterozygosis. I could show that the patient fibroblasts display impaired cell growth, which is due to accelerated senescence of the cells rather than increased cell death.