Biochemical characterization of disease-related alleles of human Telomerase RNA (hTR)
Date issued
Authors
Editors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
License
Abstract
Telomere sind die Endbereiche von Chromosomen, die sie vor einem Verfall sowie der Verschmelzung mit anderen Chromosomen schützen. Sie bestehen aus dem sich wiederholenden DNA-Hexamer 5'-GGTTAG-3', dessen Länge beim Menschen 10 bis 15 kbp beträgt, mit 100 bis 200 bps einzelsträngigem 3'-Überhang. Die wichtigste Strategie, um der Telomerverkürzung entgegenzuwirken, die sowohl von Stammzellen als auch von den meisten Tumoren genutzt wird, ist die Aktivität der Telomerase. Die Kernkomponenten der menschlichen Telomerase sind die katalytische Proteinuntereinheit Telomerase Reverse Transcriptase (TERT) und die menschliche Telomerase-RNA (hTR). hTERT ist in der Lage, die endständigen DNA-Sequenzen, die bei der DNA-Replikation während der Zellteilung verloren gehen, durch wiederholte reverse Transkription der in hTR enthaltenen Template-Region auf die Chromosomenenden zu ergänzen.
Mutationen in verschiedenen Komponenten der Telomerase, sowie in Faktoren, die an ihrer Biogenese beteiligt sind, wurden bei Patienten mit Telomerbiologie-Störungen (TBDs) festgestellt. Durch die Beeinträchtigung der Telomerasefunktion beschleunigen diese Mutationen die Verkürzung der Telomere, was zu einer Reduktion der Stammzellen in verschiedenen Geweben führt.
Das Ziel dieser Arbeit ist es, zu verstehen, wie verschiedene Regionen der hTR die Telomerase-Biogenese und -Aktivität beeinflussen. Zunächst konzentrierte ich mich auf die Untersuchung der 5'-terminalen Region von hTR, die G-reich ist und bekanntermaßen G-Quadruplex-Strukturen (G4) bildet, sowie mit der Helikase DHX36 und den heterogenen nuklearen Ribonukleoproteinen hnRNP H/F interagiert. Unter Ausnutzung von zwei bekannten krankheitsbezogenen Mutationen von hTR in dieser Region, insbesondere der Transversion G>C an Position 2 (G2C) und G>T an Position 11 (G11T), habe ich hauptsächlich die Ansätze der qPCR und der direkten Telomerase-Aktivitäts-Assays (DTAAs) verwendet, um die Bedeutung dieser Region für die hTR-Expression und Telomerase-Aktivität zu testen. Darüber hinaus untersuchte ich die Beteiligung von DHX36 und hnRNP H1 (eines der hnRNP H/F-Proteine, die mit hTR interagieren) an denselben Prozessen durch Depletion und Überexpression dieser Proteine in Zellen, die entweder Wildtyp (WT) oder mutierte hTR exprimieren. Insgesamt konnte ich zeigen, dass beide hTR-Mutationen die Telomerase-Aktivität verringern, ohne die Telomerase-Prozessivität zu beeinträchtigen, und dass sie im Vergleich zu WT-hTR auf einem ähnlichen Niveau exprimiert werden. Auch die Deletion von DHX36 selbst senkt die Telomeraseaktivität und zeigt eine additive Wirkung auf die Expression beider hTR-Mutanten. Umgekehrt erhöht die Reduktion/Depletion von hnRNP H1 die Telomeraseaktivität, während seine Überexpression die mit DTAA nachgewiesene Produktakkumulation verringert. Im zweiten Teil meiner Dissertation charakterisierte ich zwei Mutationen in der hTR-Template-Region, die Substitutionen A>G an Position 48 (A48G) und C>A an Position 50 (C50A) unter Verwendung der zuvor erwähnten Ansätze. Beide Mutanten zeigen eine stark verringerte Prozessivität der Telomerase, werden aber im Vergleich zu WT-hTR in ähnlichem Maße exprimiert. Nach weiterer Charakterisierung der C50A-hTR-Mutante zeigen meine Ergebnisse, dass die Template-Mutationen die Telomererhaltung auf verschiedene Weise beeinflussen. Erstens verursachen sie im mutierten Enzym eine Verschiebung von Translokation zu Dissoziation. Zweitens ist die Verlängerungsaktivität der WT-Telomerase beeinträchtigt, sobald mutierte Wiederholungen am Ende eines Telomers vorhanden sind. Drittens ist es wahrscheinlich, dass der Einbau der mutierten Wiederholungen in die Telomere die Wechselwirkungen mit Telomer-bindenden Proteinen und dadurch die Schutzfunktion von Shelterin beeinträchtigt. Abschließend begann ich mit der Charakterisierung von Fibroblastenzellen, die von einem Patienten mit Dyskeratosis Congenita isoliert wurden, der die Mutation C50A-hTR und eine weitere Miss-Sense-Mutation im RTEL1-Gen (ebenfalls an der Telomererhaltung beteiligt) in Heterozygotie trägt. Ich konnte zeigen, dass die Fibroblasten des Patienten ein beeinträchtigtes Zellwachstum aufweisen, was eher auf eine beschleunigte Seneszenz der Zellen als auf einen erhöhten Zelltod zurückzuführen ist.