Isolierung von milchsäurebildenden Bakterien aus Biogasanlagen
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In dieser Arbeit sollte die Bildung von Milchsäure als Zwischenprodukt der anaeroben Abbaukette in Biogasanlagen näher betrachtet werden. Es wurden fünf verschiedene mesophile Biogasanlagen beprobt, die mit nachwachsenden Rohstoffen, vornehmlich Mais- und Grassilage, sowie flüssigen Inputstoffen wie Rinder- oder Schweinegülle gefüttert wurden. Für die Isolierung milchsäurebildender Bakterien aus Biogasanlagen wurden zahlreiche Medien und verschiedene Isolierungsstrategien angewandt, um möglichst viele verschiedene Arten zu gewinnen. Insgesamt konnte bei 199 Isolaten eine Milchsäurebildung nachgewiesen werden, die wiederum 21 verschiedenen Arten oder Gruppen, die mehrere Arten beinhalteten, zugeordnet werden konnten. Mit Hilfe einer 16S rDNA-Sequenzanalyse konnten die isolierten Milchsäurebildner identifiziert werden. Die Isolate gehörten den Ordnungen Lactobacillales, Bacillales und Clostridiales an. Mehr als die Hälfte der Isolate konnten als Milchsäurebakterien identifiziert werden, die sich durch die Bildung von Milchsäure als Hauptprodukt auszeichneten. Neben zahlreichen obligat heterofermentativen Milchsäurebakterien der Gattung Lactobacillus, die neben Milchsäure auch Essigsäure, Ethanol und Kohlenstoffdioxid bilden konnten (Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. farraginis, Lb. kefiri, Lb. mucosae, Lb. parafarraginis, Lb. rapi, Lb. rossiae), wurden auch obligat homofermentative Arten (Pediococcus parvulus, Streptococcus equinus-Gr.-Isolat), sowie ein fakultativ heterofermentatives Milchsäurebakterium (Pediococcus acidilactici) identifiziert. Weiterhin wurden Arten der Gattung Bacillus (B. aerophilus-Gr.-Isolat, B. cereus-Gr., B. coagulans, B. licheniformis, B. pumilus, B. thermoamylovorans), Clostridium (C. aminovalericum und C. botulinum-Gr.-Isolat) und ein Pseudoramibacter alactolyticus-verwandter Stamm isoliert. Da Milchsäurebakterien auch beim Silierungsprozess eine zentrale Rolle spielen, gelangen diese bereits durch den Einsatz von Silage als Hauptsubstrat für Biogasanlagen in höherer Zellzahl in den Fermenter. Dementsprechend wurde hauptsächlich die Art Lb. buchneri isoliert, die dafür bekannt ist, sich gegenüber anderen Mikroorganismen im Silierungsprozess durchzusetzen.
Auf Grundlage von Untersuchungen bezüglich der Abbaufähigkeit spezieller Kohlenhydratverbindungen konnte gezeigt werden, dass die Lactobacillus- und Bacillus-Isolate ein breites Spektrum an relevanten Kohlenhydratverbindungen zu Säuren abbauen können. Zudem wurde belegt, dass die Bacillus-Isolate eine Vielzahl an Polymeren abbauen können, die in einer Biogasanlage von Bedeutung sind. Es konnte somit bewiesen werden, dass die Lactobacillus- und Bacillus-Isolate an der Acidogenese und die Bacillus-Isolate zusätzlich an der ersten Abbaustufe, der Hydrolyse des Ausgangsmaterials, beteiligt sind.
Weiterhin ist es gelungen ein qualitatives Nachweissystem für 14 isolierte Arten zu entwickeln, wodurch eine schnelle Identifizierung mit Hilfe einer Multiplex-PCR auf Artebene möglich ist. Zudem konnte ein Nachweisverfahren zur Quantifizierung von insgesamt 17 Isolaten mit Hilfe der qPCR erfolgreich etabliert werden. Die Entwicklung spezies- oder isolatspezifischer Primer erlaubte hierbei die Detektion einzelner milchsäurebildender Isolate in einer Größenordnung von ca. 1.000 bis 1.000.000 Kopien eines spezifischen Genomabschnitts pro g Fermenterprobe. Besonders für das Isolat der S. equinus-Gr. konnten hohe Kopienzahlen bestimmt werden. Die zusätzliche Isolierung dieses homofermentativen Milchsäurebakteriums aus einem Medium mit Stärke als Kohlenstoffquelle könnte auf eine zentrale Rolle dieses Isolates hindeuten. Auch für die obligat oder fakultativ heterofermentativen Milchsäurebakterien Lb. buchneri, Lb. brevis, Lb. parafarraginis, Lb. rapi und P. acidilactici wurden hohe Kopienzahlen bestimmt. Die Durchführung der Lebendkeimzahlbestimmung durch die MPN-Methode bewies darüber hinaus, dass die Milchsäurebildner in einer Größenordnung von 100.000 bis 10.000.000 Zellen pro g Fermenterprobe noch immer lebensfähig waren.
Durch diese Arbeit konnten neue Einblicke in die Acidogenese, insbesondere in die Milchsäurebildung, gewonnen werden. Besonders die Erkenntnisse über die an der Milchsäurebildung beteiligten Bakterien können zur Problembehebung bei Überschuss an Propionsäure oder mikrobiell verursachten Schwierigkeiten durch den Nachweis von einzelnen Species herangezogen werden.