Authors:	Bohn, Jelena
Title:	Isolierung von milchsäurebildenden Bakterien aus Biogasanlagen
Online publication date:	31-Oct-2016
Year of first publication:	2016
Language:	german
Abstract:	In dieser Arbeit sollte die Bildung von Milchsäure als Zwischenprodukt der anaeroben Abbaukette in Biogasanlagen näher betrachtet werden. Es wurden fünf verschiedene mesophile Biogasanlagen beprobt, die mit nachwachsenden Rohstoffen, vornehmlich Mais- und Grassilage, sowie flüssigen Inputstoffen wie Rinder- oder Schweinegülle gefüttert wurden. Für die Isolierung milchsäurebildender Bakterien aus Biogasanlagen wurden zahlreiche Medien und verschiedene Isolierungsstrategien angewandt, um möglichst viele verschiedene Arten zu gewinnen. Insgesamt konnte bei 199 Isolaten eine Milchsäurebildung nachgewiesen werden, die wiederum 21 verschiedenen Arten oder Gruppen, die mehrere Arten beinhalteten, zugeordnet werden konnten. Mit Hilfe einer 16S rDNA-Sequenzanalyse konnten die isolierten Milchsäurebildner identifiziert werden. Die Isolate gehörten den Ordnungen Lactobacillales, Bacillales und Clostridiales an. Mehr als die Hälfte der Isolate konnten als Milchsäurebakterien identifiziert werden, die sich durch die Bildung von Milchsäure als Hauptprodukt auszeichneten. Neben zahlreichen obligat heterofermentativen Milchsäurebakterien der Gattung Lactobacillus, die neben Milchsäure auch Essigsäure, Ethanol und Kohlenstoffdioxid bilden konnten (Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. farraginis, Lb. kefiri, Lb. mucosae, Lb. parafarraginis, Lb. rapi, Lb. rossiae), wurden auch obligat homofermentative Arten (Pediococcus parvulus, Streptococcus equinus-Gr.-Isolat), sowie ein fakultativ heterofermentatives Milchsäurebakterium (Pediococcus acidilactici) identifiziert. Weiterhin wurden Arten der Gattung Bacillus (B. aerophilus-Gr.-Isolat, B. cereus-Gr., B. coagulans, B. licheniformis, B. pumilus, B. thermoamylovorans), Clostridium (C. aminovalericum und C. botulinum-Gr.-Isolat) und ein Pseudoramibacter alactolyticus-verwandter Stamm isoliert. Da Milchsäurebakterien auch beim Silierungsprozess eine zentrale Rolle spielen, gelangen diese bereits durch den Einsatz von Silage als Hauptsubstrat für Biogasanlagen in höherer Zellzahl in den Fermenter. Dementsprechend wurde hauptsächlich die Art Lb. buchneri isoliert, die dafür bekannt ist, sich gegenüber anderen Mikroorganismen im Silierungsprozess durchzusetzen. Auf Grundlage von Untersuchungen bezüglich der Abbaufähigkeit spezieller Kohlenhydratverbindungen konnte gezeigt werden, dass die Lactobacillus- und Bacillus-Isolate ein breites Spektrum an relevanten Kohlenhydratverbindungen zu Säuren abbauen können. Zudem wurde belegt, dass die Bacillus-Isolate eine Vielzahl an Polymeren abbauen können, die in einer Biogasanlage von Bedeutung sind. Es konnte somit bewiesen werden, dass die Lactobacillus- und Bacillus-Isolate an der Acidogenese und die Bacillus-Isolate zusätzlich an der ersten Abbaustufe, der Hydrolyse des Ausgangsmaterials, beteiligt sind. Weiterhin ist es gelungen ein qualitatives Nachweissystem für 14 isolierte Arten zu entwickeln, wodurch eine schnelle Identifizierung mit Hilfe einer Multiplex-PCR auf Artebene möglich ist. Zudem konnte ein Nachweisverfahren zur Quantifizierung von insgesamt 17 Isolaten mit Hilfe der qPCR erfolgreich etabliert werden. Die Entwicklung spezies- oder isolatspezifischer Primer erlaubte hierbei die Detektion einzelner milchsäurebildender Isolate in einer Größenordnung von ca. 1.000 bis 1.000.000 Kopien eines spezifischen Genomabschnitts pro g Fermenterprobe. Besonders für das Isolat der S. equinus-Gr. konnten hohe Kopienzahlen bestimmt werden. Die zusätzliche Isolierung dieses homofermentativen Milchsäurebakteriums aus einem Medium mit Stärke als Kohlenstoffquelle könnte auf eine zentrale Rolle dieses Isolates hindeuten. Auch für die obligat oder fakultativ heterofermentativen Milchsäurebakterien Lb. buchneri, Lb. brevis, Lb. parafarraginis, Lb. rapi und P. acidilactici wurden hohe Kopienzahlen bestimmt. Die Durchführung der Lebendkeimzahlbestimmung durch die MPN-Methode bewies darüber hinaus, dass die Milchsäurebildner in einer Größenordnung von 100.000 bis 10.000.000 Zellen pro g Fermenterprobe noch immer lebensfähig waren. Durch diese Arbeit konnten neue Einblicke in die Acidogenese, insbesondere in die Milchsäurebildung, gewonnen werden. Besonders die Erkenntnisse über die an der Milchsäurebildung beteiligten Bakterien können zur Problembehebung bei Überschuss an Propionsäure oder mikrobiell verursachten Schwierigkeiten durch den Nachweis von einzelnen Species herangezogen werden. In the present work lactic acid forming bacteria were isolated from five different mesophilic biogas plants. The fermenters were fed with renewable raw materials, mainly maize silage and manure from cattle or pig. For the isolation several media and isolation strategies were used to receive different species of lactic acid forming bacteria. Overall, for 199 of the obtained isolates lactic acid formation was proved. In total, the isolates could be clustered in 21 different species depending on their characteristic SAPD-PCR band patterns. According to 16S rRNA gene sequence analyses, the isolates belonged to the phyla Firmicutes and to the orders Lactobacillales, Bacillales and Clostridiales. More than half of the isolates belonged to the lactic acid bacteria and produced lactic acid as main product. Besides many obligate heterofermentative Lactobacillus species, which formed lactic acid, acetic acid or ethanol as well as carbon dioxide (Lb. brevis, Lb. buchneri, Lb. farraginis, Lb. kefiri, Lb. mucosae, Lb. parafarraginis, Lb. rapi, Lb. rossiae), obligate homofermentative (Pediococcus parvulus, Streptococcus equinus group) and a facultative heterofermentative lactic acid bacterium were also isolated (Pediococcus acidilactici). In addition, several species of the genus Bacillus (B. aerophilus group, B. cereus group, B. coagulans, B. licheniformis, B. pumilus, B. thermoamylovorans) and Clostridium (C. aminovalericum und C. botulinum group) as well as a Pseudoramibacter alactolyticus related strain were received. The most often isolated bacterium was Lb. buchneri, which is well known to be the dominating Lactobacillus species in silage. The investigations for degradability of some carbohydrates indicated that Lactobacillus and Bacillus isolates were able to use a wide range of mono- and oligosaccharides. Moreover, Bacillus isolates showed a degradability of many polymers. Based on these results Lactobacillus isolates are involved in the acidogenetic step of anaerobic fermentation in biogas plants and Bacillus isolates additionally in the hydrolytic step. For most of the isolates a qualitative multiplex system and a quantitative real time PCR detection could be realized by development of isolate-specific primer. Quantitative results revealed mainly 1000 – 1000000 copies of a specific genome sequence per g fermenter sample. Especially for the isolates S. equinus group, Lb. buchneri, Lb. brevis, Lb. parafarraginis, Lb. rapi and P. acidilactici a high copy value was determined. Furthermore, the isolation of the S. equinus group bacterium in a medium with starch as sole carbon source pointed out that this strain probably possess a role in the hydrolytic and acidogenetic step of anaerobic fermentation in biogas plants. Viable cell counts of 100000 – 10000000 cells per ml fermenter sample demonstrated that the lactic acid bacteria were still viable. The results of the present study provide novel insights into acidogenesis of mesophilic biogas plants regarding lactic acid formation. Especially new findings about the diversity of lactic acid forming bacteria and the development of a fast detection could be helpful to solve problems based on propionic acid excess or other microbial caused disturbances in biogas plants.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-1042
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000007554
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	III, 134 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen