Analysis of translationally active RNAs : quantification by microscale thermophoresis and modification analysis by LC-MS/MS
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RNA, und tRNA im Besonderen, spielen nicht nur in grundlegenden zellulären Prozessen wie der Translation der genetischen Information eine wichtige Rolle, sondern erfüllen auch eine Vielzahl an regulatorischen Funktionen, zum Beispiel in der Reaktion auf verschiedenste Stressfaktoren. Weiterhin zeigt die Beteiligung von RNA an der Pathophysiologie verschiedener Krankheiten, wie zum Beispiel Tumor- sowie neurobiologischen Erkrankungen, die Wichtigkeit einer engen Kontrolle der zellulären Dynamik von RNAs. Diese Kontrolle beinhaltet, insbesondere im Fall der tRNAs, dynamische Veränderungen sowohl in der Menge einzelner RNAs als auch in deren Modifikationsmustern. Um weitere Funktionen einzelner RNA-Moleküle in der Regulation zellulärer Abläufe und ihren Einfluss auf Erkrankungen aufdecken zu können, sind daher detaillierte Untersuchungen sowohl von (t)RNA-Leveln als auch von ihren Modifikationen erforderlich.
In dieser Arbeit wurden unterschiedliche Ansätze gewählt, um der Herausforderung einer detaillierten Analyse von RNA-Molekülen entgegenzutreten. Hierzu gehörten die Isolation einzelner RNAs, ihre Quantifizierung und die Analyse von RNA Modifikationen. Mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden wurde eine auf Thermophorese basierende Methode zur RNA-Quantifizierung entwickelt, die sowohl auf einzelne RNA-Moleküle als auch auf die Gruppe der polyadenylierten RNAs angewendet wurde. Weiterhin zeigte die sehr schnell durchführbare Methode eine sehr hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Erfolgreiche Anwendung fand die Methode in der Quantifizierung von tRNAs aus S. cerevisiae unter verschiedenen äußeren und genetischen Bedingungen, wie Temperaturstress und Defekten in tRNA Modifikationen. Hierbei konnten geringfügige, aber dennoch zum Teil signifikante Unterschiede in tRNA-Leveln festgestellt werden, was die hohe Eignung der Methode für Untersuchungen von relativen Veränderungen in RNA-Häufigkeiten bestätigte. Zusätzlich konnte mithilfe der Methode eine ausgeprägte Verringerung der mRNA Menge unter PaT Killer Toxin-Behandlung beobachtet werden, die auch zu einer drastischen Reduktion von tRNAGln führte. Mittels Hybridisierung und Affinitätsaufreinigung wurden unter Verwendung derselben DNA-Sonden (zusätzlich mit Biotin markiert) verschiedene (t)RNAs erfolgreich aus RNA-Mischungen isoliert. Hierbei wurde die kleine, tRNA-ähnliche und möglicherweise immunregulatorische mascRNA als besondere Ziel-RNA ausgewählt, deren Präkursor-RNA, MALAT1, entscheidend an der Progression von Tumorerkrankungen beteiligt ist. Auch wenn die Isolation der mascRNA letztendlich nicht erfolgreich war, konnten die Ergebnisse des RNA-Seq eine Anreicherung der mascRNA, wenn auch von schwacher Signifikanz, belegen sowie eine mögliche 1-Methyladenosin-Modifikation zeigen. Des Weiteren ist die Analyse von RNA-Modifikation für eine vollständige Charakterisierung eines RNA-Moleküls erforderlich. Mittels LC-MS/MS in verschiedenen Detektionsmodi wurden Veränderungen in tRNA-U34 Modifikationen in Hefe-Mutanten quantifiziert, die Einführung von Queuosin in S. Pombe tRNA gezeigt, die erfolgreiche Isolation von tRNAs bestätigt sowie die Position von 13C-Markierungen in den Nukleobasen von E. coli untersucht.