Authors:	Thüring, Kathrin Luise
Title:	Analysis of translationally active RNAs : quantification by microscale thermophoresis and modification analysis by LC-MS/MS
Online publication date:	20-Dec-2016
Year of first publication:	2016
Language:	english
Abstract:	RNA, und tRNA im Besonderen, spielen nicht nur in grundlegenden zellulären Prozessen wie der Translation der genetischen Information eine wichtige Rolle, sondern erfüllen auch eine Vielzahl an regulatorischen Funktionen, zum Beispiel in der Reaktion auf verschiedenste Stressfaktoren. Weiterhin zeigt die Beteiligung von RNA an der Pathophysiologie verschiedener Krankheiten, wie zum Beispiel Tumor- sowie neurobiologischen Erkrankungen, die Wichtigkeit einer engen Kontrolle der zellulären Dynamik von RNAs. Diese Kontrolle beinhaltet, insbesondere im Fall der tRNAs, dynamische Veränderungen sowohl in der Menge einzelner RNAs als auch in deren Modifikationsmustern. Um weitere Funktionen einzelner RNA-Moleküle in der Regulation zellulärer Abläufe und ihren Einfluss auf Erkrankungen aufdecken zu können, sind daher detaillierte Untersuchungen sowohl von (t)RNA-Leveln als auch von ihren Modifikationen erforderlich. In dieser Arbeit wurden unterschiedliche Ansätze gewählt, um der Herausforderung einer detaillierten Analyse von RNA-Molekülen entgegenzutreten. Hierzu gehörten die Isolation einzelner RNAs, ihre Quantifizierung und die Analyse von RNA Modifikationen. Mit Hilfe von fluoreszenzmarkierten DNA-Sonden wurde eine auf Thermophorese basierende Methode zur RNA-Quantifizierung entwickelt, die sowohl auf einzelne RNA-Moleküle als auch auf die Gruppe der polyadenylierten RNAs angewendet wurde. Weiterhin zeigte die sehr schnell durchführbare Methode eine sehr hohe Reproduzierbarkeit der Ergebnisse. Erfolgreiche Anwendung fand die Methode in der Quantifizierung von tRNAs aus S. cerevisiae unter verschiedenen äußeren und genetischen Bedingungen, wie Temperaturstress und Defekten in tRNA Modifikationen. Hierbei konnten geringfügige, aber dennoch zum Teil signifikante Unterschiede in tRNA-Leveln festgestellt werden, was die hohe Eignung der Methode für Untersuchungen von relativen Veränderungen in RNA-Häufigkeiten bestätigte. Zusätzlich konnte mithilfe der Methode eine ausgeprägte Verringerung der mRNA Menge unter PaT Killer Toxin-Behandlung beobachtet werden, die auch zu einer drastischen Reduktion von tRNAGln führte. Mittels Hybridisierung und Affinitätsaufreinigung wurden unter Verwendung derselben DNA-Sonden (zusätzlich mit Biotin markiert) verschiedene (t)RNAs erfolgreich aus RNA-Mischungen isoliert. Hierbei wurde die kleine, tRNA-ähnliche und möglicherweise immunregulatorische mascRNA als besondere Ziel-RNA ausgewählt, deren Präkursor-RNA, MALAT1, entscheidend an der Progression von Tumorerkrankungen beteiligt ist. Auch wenn die Isolation der mascRNA letztendlich nicht erfolgreich war, konnten die Ergebnisse des RNA-Seq eine Anreicherung der mascRNA, wenn auch von schwacher Signifikanz, belegen sowie eine mögliche 1-Methyladenosin-Modifikation zeigen. Des Weiteren ist die Analyse von RNA-Modifikation für eine vollständige Charakterisierung eines RNA-Moleküls erforderlich. Mittels LC-MS/MS in verschiedenen Detektionsmodi wurden Veränderungen in tRNA-U34 Modifikationen in Hefe-Mutanten quantifiziert, die Einführung von Queuosin in S. Pombe tRNA gezeigt, die erfolgreiche Isolation von tRNAs bestätigt sowie die Position von 13C-Markierungen in den Nukleobasen von E. coli untersucht. RNAs, and tRNAs in particular, play important roles not only in basic cellular processes like the translation of the genetic information, but also fulfil a variety of regulatory functions for example in the cell’s response to various environmental stress factors and challenges. Furthermore, the involvement of RNA species in the pathophysiology of a number of human diseases, including cancer and neurobiological disorders, highlights the importance of a tight regulation of cellular RNA dynamics. Especially in case of tRNAs, regulation includes both dynamic changes in abundance and in RNA modification pattern. Hence, detailed investigations of both variations in (t)RNA levels and in their content of modifications are necessary to further uncover RNA functions in the regulation of cellular processes and the impact of RNA species on human diseases. In this work, various approaches were applied to address the need for a detailed analysis of specific RNA species, including their isolation, quantification and modification analysis. Making use of fluorescently labelled DNA probes, an RNA quantification method based on microscale thermophoresis was developed, which showed not only to be applicable to both single RNA species as well as the subgroup of polyadenylated RNA, but also to be highly reproducible and extremely fast to conduct. The successful application to the quantification of most S. cerevisiae tRNA species revealed small, but in part significant changes of tRNA isoacceptor levels under various environmental and genetic conditions (e.g. temperature stress and RNA modification deficiencies), underlining the method’s excellent suitability for examination of changes in relative tRNA abundances. Furthermore, a considerable reduction of mRNA abundance in S. cerevisiae, which was shown to be depleted of tRNAGln due to PaT killer toxin treatment, was observed. Using the same DNA probes, additionally tagged with biotin, various single (t)RNA species were successfully isolated from RNA mixtures employing a hybridization- and affinity purification-based protocol. The potentially immunoregulatory small tRNA-like mascRNA, whose precursor long non-coding RNA MALAT1 is a key factor in cancer progression, was chosen in particular as an attractive target for an isolation with subsequent RNA modification analysis by LC-MS/MS. Although the isolation of mascRNA was ultimately unsuccessful, RNA-Seq results still revealed an enrichment of mascRNA, albeit marginally significant, and furthermore suggested the presence of an 1-methyladenosine modification. Analysis of an RNA’s modification pattern is likewise important to assess the full range of the RNA’s characteristics and functions. Here, highly sensitive LC-MS/MS analysis was employed to quantify changes in wobble U34 modifications present in the anticodon loop of tRNAs in various mutants of S. cerevisiae. Making use of different scan modi and instrument settings, further investigations included the prove of an introduction of queuosine into S. pombe tRNA, the verification of the successful isolation of single tRNA species and the confirmation of 13C-labeling patterns of nucleobases in E. coli RNA.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-4597
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000008949
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	xx, 153 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen