Competitive interplay between xenophagy and viral evasion mechanisms of autophagy during human cytomegalovirus infection

Abstract

Die Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) wird auf verschiedenen Ebenen durch zelleigene Abwehrmechanismen kontrolliert. Die selektive Autophagie stellt einen derartigen Mechanismus dar. Bei dieser Form der Autophagie, die auch als Xenophagie bezeichnet wird, spielen Autophagierezeptoren eine zentrale Rolle. Diese Rezeptoren erkennen die viralen Moleküle (Cargo) und leiten sie zu den Autophagosomen. Nach der Verschmelzung des Autophagosoms mit dem Lysosom wird das Cargo abgebaut und recycelt. Bislang war jedoch das Zusammenspiel zwischen HCMV und Autophagie nur unzureichend verstanden, es wurde sowohl eine antivirale als auch eine provirale Rolle der Autophagie beschrieben. Um ein besseres Verständnis über diese Vorgänge zu erlangen, wurde die Rolle der beiden Autophagierezeptoren SQSTM1/p62 und Optineurin, sowie einiger potenzieller Autophagierezeptoren aus der Tripartite-motif (TRIM) Proteinfamilie während einer HCMV-Infektion analysiert. Zur Analyse der Interaktion von SQSTM1/p62 mit viralen Proteinen wurde die Methodik der Ko-Immunopräzipitation (Ko-IP) in Kombination mit massenspektrometrischen (MS) Analysen eingesetzt. Es zeigte sich, dass SQSTM1/p62 mit fast allen viralen Kapsidproteine interagierte. Dies bestätigte die Ergebnisse unserer früheren Studie. Auffallend war, dass auch mehrere Proteine des Kernporenkomplexes (NPC) als Interaktionspartner von SQSTM1/p62 identifiziert wurden. Da SQSTM1/p62 als nukleozytoplasmatisches Shuttleprotein bekannt ist, sind diese Ergebnisse plausibel und legen nahe, dass SQSTM1/p62 über die Interaktion mit dem NPC Kapsidstrukturen aus dem Zellkern, ähnlich wie aus dem Zytoplasma zum Abbau zu den Autophagosomen transportiert. Um den Einfluss des Rezeptors auf die HCMV-Infektion weiter zu untersuchen, wurden SQSTM1/p62-Knockout-Zellen erzeugt. Diese Zellen wurden infiziert und anschließend die virale DNA-Replikation und die Synthese von Tochterviren untersucht. Das Fehlen von SQSTM1/p62 hatte keinen Einfluss auf die virale Genomreplikation, wohl aber auf die Freisetzung von viralen Nachkommen, die erhöht war. Dies deutete darauf hin, dass die antivirale Wirkung von SQSTM1/p62 auf Vorgänge abzielt, die zur späten Phase der viralen Infektion, nach Beginn der viralen Genomreplikation ablaufen. Dies stimmte auch mit der Vorstellung überein, dass die virale Infektion durch die Interaktion von SQSTM1/p62 mit viralen Kapsidkomponenten im Prozess der Partikelmorphogenese kontrolliert wird. Weitere Analysen zeigten, dass das Fehlen von SQSTM1/p62 bei einer HCMV-Infektion die Interferon-Antwort durch einen Anstieg an Interferon-stimulierten Genprodukten (ISGs) verstärkt. ISGs sind dafür bekannt, dass sie die virale Replikation auf mehreren Ebenen einschränken. Aus diesen Ergebnissen ließ sich ableiten, dass SQSTM1/p62 durch Kontrolle der ISG-Expression die Virusinfektion begünstigt, während es gleichzeitig den Abbau von viralen Kapsidproteinen vermittelt. Dieser Widerspruch lässt sich durch die bekannte Funktion der Autophagie in der Kontrolle einer übermäßigen Interferonantwort erklären. SQSTM1/p62 könnte so während einer HCMV-Infektion eine ausgleichende Rolle zwischen dem Abbau viraler Komponenten und der Verhinderung von Zellschäden durch eine überschießende Interferonantwort spielen. Die Ergebnisse deuten zusammengefasst darauf hin, dass SQSTM1/p62 ein wichtiger Regulator der Autophagie während einer HCMV-Infektion ist, der sowohl virale als auch zelluläre Mechanismen kontrolliert. In einem weiteren Teil der Arbeit wurden die Auswirkungen der Phosphorylierung von SQSTM1/p62 auf die HCMV-Infektion untersucht. Einzelne Funktionen der Autophagierezeptoren, wie z.B. ihre Affinität zum Cargo und den autophagosomalen Membranen werden durch Phosphorylierung reguliert. Die MS Analysen zeigten, dass SQSTM1/p62 bei einer HCMV-Infektion ausschließlich an Position S272 verstärkt phosphoryliert wird. Der Phosphorylierungsstatus aller anderen, bekannten Phosphorylierungsstellen von SQSTM1/p62 wurde durch die HCMV-Infektion nicht beeinflusst. Um die Rolle der Phosphorylierung an S272 bei einer HCMV-Infektion näher zu untersuchen, wurden HCMV-Mutanten hergestellt, die verschiedene Versionen von SQSTM1/p62 exprimierten. So wurde ein Virus hergestellt, das den Rezeptor in seiner Wildtyp-Konfiguration (S272) exprimierte. Weitere Viren wurden kloniert, die eine Version von SQSTM1/p62 exprimierten, in der Serin durch Asparaginsäure oder Glutaminsäure ersetzt wurde (S272D und S272E). Eine derartige Modifikation ahmt die Phosphorylierung an Position S272 nach. Schließlich wurde ein Virus hergestellt, in dem Serin durch Alanin an Position S272 ersetzt wurde (S272A). Alanin kann nicht phosphoryliert werden. Die Bindung der verschiedenen Versionen des Rezeptors an das Cargo wurde in Ko-IP- und MS-Analysen nach Infektion von SQSTM1-Knockout-Zellen mit den rekombinanten Viren untersucht. Hierbei zeigten sich keine Unterschiede in der Bindungsfähigkeit von SQSTM1/p62 an zelluläre und virale Proteine. Die Phosphorylierung an S272 reduzierte jedoch den proteasomalen Abbau von SQSTM1/p62, was zu einer Anreicherung des Rezeptors und zu erhöhten ISG-Proteinspiegeln in HCMV-infizierten Zellen führte. Dies war von einer verringerten Freisetzung von Tochterviren begleitet. Obwohl SQSTM1/p62 also die ISG-Proteinkonzentration einschränkt, wie im ersten Teil der Arbeit festgestellt wurde, scheint die Phosphorylierung an S272 die IFN-I-Induktion zu verstärken. Die S272-Phosphorylierung scheint also ein entscheidender Faktor zu sein, der die Interferenz von SQSTM1/p62 und Autophagie bei IFN-I-Reaktionen reguliert. Um festzustellen, ob die HCMV-Kinase pUL97 an der Phosphorylierung von SQSTM1/p62 an S272 beteiligt ist, wurde eine analog-sensitive Version dieser Kinase (pUL97-as1) verwendet. Das mutierte Gen (UL97-as1) exprimiert eine Version von pUL97, die durch Behandlung mit dem ATP-Analogon 3MB-PP1 spezifisch und reversibel gehemmt werden kann. Durch Ersetzen des wt-UL97-Gens durch UL97-as1 wurde ein rekombinantes HCMV erzeugt. Die Infektion von Zellen mit dieser Mutante in Gegenwart von 3MB-PP1 führte zur verminderten Phosphorylierung von SQSTM1/p62 an S272. Dies deutet darauf hin, dass pUL97 an der Phosphorylierung des Rezeptors beteiligt ist. Das Ergebnis konnte durch Ko-Transfektionsexperimente bestätigt werden. Eine In-vitro-Kinase-Analyse konnte jedoch keine direkte Phosphorylierung von SQSTM1/p62 durch pUL97 nachweisen, was auf eine indirekte Wirkung der viralen Kinase auf die Phosphorylierung des Rezeptors hinweist. Diese Ergebnisse waren überraschend, da die Experimente im vorangegangenen Abschnitt gezeigt hatten, dass die S272-Phosphorylierung die Produktion von HCMV-Tochterviren behindert. Es bleibt unklar, warum pUL97 eine antivirale Wirkung vermitteln sollte. Dies könnte jedoch durch die vielfältigen Funktionen der viralen Kinase zur Unterstützung der viralen Infektion erklärt werden, die zufälligerweise auch zur S272-Phosphorylierung durch eine zelluläre Kinase führen könnten. Weitere Experimente sind notwendig, um die Auswirkungen von pUL97 auf die Funktion von SQSTM1/p62 und auf die Autophagie zu untersuchen. Neben SQSTM1/p62 wurde auch der Autophagierezeptor Optineurin und seine Rolle während einer HCMV-Infektion untersucht. Überraschenderweise konnte durch Ko-IP- und MS-Analysen nur ein HCMV-Protein, nämlich pUL84, als Bindepartner von Optineurin identifiziert werden. Interessanterweise interagierte pUL84 auch mit SQSTM1/p62. Da pUL84 eine Schlüsselkomponente des DNA-Replikationskomplexes ist, deutet dies auf eine mögliche Interferenz von Optineurin mit der viralen Genomreplikation hin. Die Infektion von Optineurin-Knockout-Zellen zeigte jedoch keine Beeinträchtigung der HCMV-Genomreplikation und der Freisetzung von Nachkommen. Weitere Analysen hierzu, z.B. in Bezug auf verschiedene Zelltypen, gehen über den Rahmen dieser Arbeit hinaus und sollen in weiteren Studien untersucht werden. In einem weiteren Abschnitt wurde die Rolle von ausgewählten TRIMs während der HCMV-Infektion untersucht. TRIM25, TRIM26 und TRIM32 konnten wir in Vorarbeiten als Bestandteile von HCMV-Virionen identifizieren. TRIM21 und TRIM28 sind bekannte Regulatoren der Autophagie. Interessanterweise konnte in Ko-IP/MS-Analysen wiederum eine Interaktion einiger dieser TRIMs mit Kapsidproteinen nachgewiesen werden. Zur weiteren Analyse wurden individuelle Knockout-Zellen hergestellt. Der Knockout der TRIMs hatte keinen Einfluss auf die Induktion der Autophagie in HCMV-infizierten Zellen. Allerdings führte der Knockout insbesondere von TRIM25 und TRIM32 zu einer erhöhten Freisetzung von Tochterviren. Einige TRIMs scheinen also tatsächlich eine Funktion bei der zellulären Abwehr bei HCMV-Infektionen wahrzunehmen. In einem letzten Abschnitt der Arbeit wurde die Rolle der immunity related GTPase Q (IRGQ) im Rahmen der HCMV-Infektion zusammen mit der Arbeitsgruppe von Lina Herhaus vom Institut für Biochemie II der Goethe-Universität Frankfurt am Main untersucht. Herhaus und Kollegen hatten IRGQ als einen neuen Regulator der Autophagie bei der Salmonella-Infektion identifiziert. Der Knock-down von IRGQ hatte keinen Einfluss auf die virale Genomreplikation. Interessanterweise führte jedoch der Knock-down dieses Proteins zu einer deutlich erhöhten Freisetzung viraler Nachkommen. Ein gleicher Effekt wurde auch nach dem Knock-down des Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein-like 2 (GABARAP-L2) beobachtet. Dieses Protein ist ein bekannter Bindungspartner von IRGQ. Die Ergebnisse haben außerdem gezeigt, dass die antivirale Wirkung von IRGQ von GABARAP-L2 abhängig ist. Zusammengefasst konnten diese Experimente IRGQ als einen neuen Regulator der HCMV-Infektion identifizieren. Der Mechanismus der antiviralen Wirkung von IRGQ muss in nachfolgenden Arbeiten adressiert werden.

Infection with the human cytomegalovirus (HCMV) is controlled on multiple levels by intrinsic defense mechanisms of the cell. Selective autophagy functions as such a mechanism by degrading viral components. In this process, which is also called xenophagy, autophagy receptors play a central role. These receptors recognize the viral cargo and direct it to the developing autophagosomes. After fusion of the autophagosome with the lysosome, the cargo is degraded and recycled. The interplay between HCMV and autophagy is only poorly understood and both antiviral and proviral roles of autophagy have been described. To gain a better knowledge of these processes, the roles of the two autophagy receptors SQSTM1/p62 and optineurin and some potential autophagy receptors of the tripartite motif (TRIM) family proteins during HCMV infection were analyzed. Co-immunoprecipitation (Co-IP) experiments combined with mass spectrometry (MS) analyses revealed that SQSTM1/p62 precipitates with several viral proteins in HCMV-infected cells. Almost all viral capsid proteins were found to interact, confirming the results of our previous study. Strikingly, the experiments also revealed that SQSTM1/p62 interacts with several proteins of the nuclear pore complex (NPC). This is in line with the knowledge that SQSTM1/p62 shuttles between the nucleus and cytoplasm via the NPC. These combined findings suggest that SQSTM1/p62 transports capsid structures from both the cytoplasm and the nucleus to autophagosomes for degradation. To further investigate the impact of the receptor on HCMV infection, SQSTM1 knockout cells were generated. Infection of these cells revealed that the absence of the receptor had no impact on viral DNA replication. Surprisingly, however, enhanced release of viral progeny was found after HCMV infection of SQSTM1 knockout cells, compared to controls. This suggests that SQSTM1/p62 expression induces an antiviral effect downstream of the initiation of viral genome replication. This fits into the hypothesis that viral infection is controlled by autophagy via the interaction of SQSTM1/p62 with viral capsid components in the process of particle morphogenesis and the subsequent degradation of these proteins. The absence of SQSTM1/p62 in HCMV-infected cells also resulted in an increase in the levels of interferon stimulated gene products (ISGs). ISGs are known to restrict viral replication on multiple levels. Thus SQSTM1/p62 impedes viral progeny production via degradation of capsid proteins while seemingly supporting viral infection by restricting type I interferon (IFN-I) signaling. This contradiction may be explained by the known function of autophagy to control excessive interferon responses. SQSTM1/p62 may thus play a balancing role during HCMV infection between degrading viral components and preventing cell damage by an extreme interferon response. The results suggest that SQSTM1/p62 is a key regulator of autophagic processes during HCMV infection, controlling both viral and cellular mechanisms. In a next part of the study, the impact of SQSTM1/p62 phosphorylation on HCMV infection was addressed. The functions of autophagy receptors, such as to link the cargo with the autophagic machinery is partly regulated by phosphorylation. Phosphoproteomic analyses revealed that SQSTM1/p62 was exclusively hyperphosphorylated at S272 upon HCMV infection. The phosphorylation status of all other known sites on SQSTM1/p62 was not affected by HCMV infection. To address the role of this S272 phosphorylation on HCMV infection, HCMV mutants were generated, which expressed different versions of SQSTM1/p62. The receptor was expressed from these recombinant viruses in either (i) its wild-type configuration (S272), or (ii) serine was replaced by aspartic acid or glutamic acid, thereby either mimicking the phosphorylation (S272D and S272E), or (iii) by replacing serine by alanine, representing a non-phosphorylated status (S272A). Infection of SQSTM1 knockout cells with these mutants, followed by Co-IP and MS analyses, did not reveal any differences between the mutant viruses, showing that the phosphorylation at S272 had no effect on binding to cellular and viral proteins. However, S272 phosphorylation impaired proteasomal degradation of SQSTM1/p62, leading to an enrichment of this receptor and increased ISG protein levels in HCMV-infected cells, accompanied by reduced viral progeny release. Thus, although SQSTM1/p62 restricts ISG protein levels, as seen in the first part of the study, phosphorylation at S272 increased IFN-I responses. This indicated that S272 phosphorylation appears to be a key switch that regulates the interference of SQSTM1/p62 and autophagy in IFN-I responses. To determine whether the HCMV kinase pUL97 was involved in the phosphorylation of SQSTM1/p62 at S272, a mutant version of this kinase (pUL97-as1) was used. The mutated gene (UL97-as1) expresses an analog-sensitive version of pUL97 which can be specifically and reversibly inhibited by treatment with the ATP analog 3MB-PP1. A recombinant HCMV mutant was generated by replacing the wt-UL97 gene with UL97-as1. Infection of cells with this virus in the presence of 3MB-PP1 resulted in decreased phosphorylation of SQSTM1/p62 at S272, suggesting that pUL97 was involved in the phosphorylation of the receptor. This was confirmed by co-transfection experiments using plasmids expressing either UL97-as1 or GFP-SQSTM1 and the addition of 3MB-PP1 with subsequently phosphoproteomic analysis. Subsequent in-vitro kinase assay, however, could not provide evidence for direct phosphorylation of SQSTM1/p62 by pUL97, indicating an indirect effect of the viral kinase on phosphorylation of the receptor. The results were surprising, as the experiments in the previous section had shown that S272 phosphorylation impeded HCMV progeny production. It remains unclear why pUL97 should mediate an antiviral effect, but this may be explained by the multiple functions of the viral kinase to support viral infection, which may fortuitously also lead to S272 phosphorylation by a cellular kinase. Further experiments are necessary to investigate the impact of pUL97 on SQSTM1/p62 function and on autophagy. Besides SQSTM1/p62, the autophagy receptor optineurin and its role during HCMV infection was addressed. Surprisingly, Co-IP and MS analyses could identify only one HCMV protein, namely pUL84, as an interactor with optineurin. Interestingly, pUL84 also interacted with SQSTM1/p62. As the viral protein is a key component of the DNA-replication complex, this suggested that there might be an interference of optineurin with viral genome replication. However, infection of optineurin knockout cells showed no impairment in HCMV genome replication and progeny release. Further analyses of this, e.g., with respect to different cell types were beyond this work and shall be addressed in further studies. In a further section, the role of selected TRIMs during HCMV infection was investigated. TRIM25, TRIM26, and TRIM32 had been identified before as components of HCMV virions. TRIM21 and TRIM28 are known regulators of autophagy. Interestingly, some of these TRIMs again interacted with viral capsid proteins. Consequently, individual knockout cells were established. The knockout of any of these TRIMs did not have an impact on the induction of autophagy in HCMV-infected cells. However, knockout of particularly TRIM25 and TRIM32 resulted in increased release of viral progeny following infection of the respective knockout cells with HCMV. Thus, some TRIMs indeed seem to function in the cellular defense against HCMV infection. In a final section, the role of the immunity related GTPase Q protein (IRGQ) during HCMV infection was analyzed in collaboration with Lina Herhaus, Institute of Biochemistry II, Goethe University Frankfurt/Main, Germany. This group had identified IRGQ as a new candidate in the regulation of autophagy upon Salmonella infection. Knockdown of IRGQ by siRNA transfection did not impair HCMV genome replication. Interestingly, the downregulation of this gene resulted in a marked increase in viral progeny release. The knockdown of gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein-like 2 (GABARAP-L2), which is an interactor of IRGQ, also resulted in elevated HCMV progeny production. Moreover, the results demonstrated that the antiviral impact of IRGQ was dependent on the presence of GABARAP-L2. Together these data identify IRGQ as a novel regulator of HCMV infection. The antiviral mechanisms that are mediated by IRGQ await further analysis.