Competitive interplay between xenophagy and viral evasion mechanisms of autophagy during human cytomegalovirus infection
Loading...
Date issued
Authors
Editors
Journal Title
Journal ISSN
Volume Title
Publisher
Reuse License
Abstract
Die Infektion mit dem humanen Cytomegalovirus (HCMV) wird auf verschiedenen Ebenen durch zelleigene Abwehrmechanismen kontrolliert. Die selektive Autophagie stellt einen derartigen Mechanismus dar. Bei dieser Form der Autophagie, die auch als Xenophagie bezeichnet wird, spielen Autophagierezeptoren eine zentrale Rolle. Diese Rezeptoren erkennen die viralen Moleküle (Cargo) und leiten sie zu den Autophagosomen. Nach der Verschmelzung des Autophagosoms mit dem Lysosom wird das Cargo abgebaut und recycelt. Bislang war jedoch das Zusammenspiel zwischen HCMV und Autophagie nur unzureichend verstanden, es wurde sowohl eine antivirale als auch eine provirale Rolle der Autophagie beschrieben. Um ein besseres Verständnis über diese Vorgänge zu erlangen, wurde die Rolle der beiden Autophagierezeptoren SQSTM1/p62 und Optineurin, sowie einiger potenzieller Autophagierezeptoren aus der Tripartite-motif (TRIM) Proteinfamilie während einer HCMV-Infektion analysiert.
Zur Analyse der Interaktion von SQSTM1/p62 mit viralen Proteinen wurde die Methodik der Ko-Immunopräzipitation (Ko-IP) in Kombination mit massenspektrometrischen (MS) Analysen eingesetzt. Es zeigte sich, dass SQSTM1/p62 mit fast allen viralen Kapsidproteine interagierte. Dies bestätigte die Ergebnisse unserer früheren Studie. Auffallend war, dass auch mehrere Proteine des Kernporenkomplexes (NPC) als Interaktionspartner von SQSTM1/p62 identifiziert wurden. Da SQSTM1/p62 als nukleozytoplasmatisches Shuttleprotein bekannt ist, sind diese Ergebnisse plausibel und legen nahe, dass SQSTM1/p62 über die Interaktion mit dem NPC Kapsidstrukturen aus dem Zellkern, ähnlich wie aus dem Zytoplasma zum Abbau zu den Autophagosomen transportiert. Um den Einfluss des Rezeptors auf die HCMV-Infektion weiter zu untersuchen, wurden SQSTM1/p62-Knockout-Zellen erzeugt. Diese Zellen wurden infiziert und anschließend die virale DNA-Replikation und die Synthese von Tochterviren untersucht. Das Fehlen von SQSTM1/p62 hatte keinen Einfluss auf die virale Genomreplikation, wohl aber auf die Freisetzung von viralen Nachkommen, die erhöht war. Dies deutete darauf hin, dass die antivirale Wirkung von SQSTM1/p62 auf Vorgänge abzielt, die zur späten Phase der viralen Infektion, nach Beginn der viralen Genomreplikation ablaufen. Dies stimmte auch mit der Vorstellung überein, dass die virale Infektion durch die Interaktion von SQSTM1/p62 mit viralen Kapsidkomponenten im Prozess der Partikelmorphogenese kontrolliert wird.
Weitere Analysen zeigten, dass das Fehlen von SQSTM1/p62 bei einer HCMV-Infektion die Interferon-Antwort durch einen Anstieg an Interferon-stimulierten Genprodukten (ISGs) verstärkt. ISGs sind dafür bekannt, dass sie die virale Replikation auf mehreren Ebenen einschränken. Aus diesen Ergebnissen ließ sich ableiten, dass SQSTM1/p62 durch Kontrolle der ISG-Expression die Virusinfektion begünstigt, während es gleichzeitig den Abbau von viralen Kapsidproteinen vermittelt. Dieser Widerspruch lässt sich durch die bekannte Funktion der Autophagie in der Kontrolle einer übermäßigen Interferonantwort erklären. SQSTM1/p62 könnte so während einer HCMV-Infektion eine ausgleichende Rolle zwischen dem Abbau viraler Komponenten und der Verhinderung von Zellschäden durch eine überschießende Interferonantwort spielen. Die Ergebnisse deuten zusammengefasst darauf hin, dass SQSTM1/p62 ein wichtiger Regulator der Autophagie während einer HCMV-Infektion ist, der sowohl virale als auch zelluläre Mechanismen kontrolliert.
In einem weiteren Teil der Arbeit wurden die Auswirkungen der Phosphorylierung von SQSTM1/p62 auf die HCMV-Infektion untersucht. Einzelne Funktionen der Autophagierezeptoren, wie z.B. ihre Affinität zum Cargo und den autophagosomalen Membranen werden durch Phosphorylierung reguliert. Die MS Analysen zeigten, dass SQSTM1/p62 bei einer HCMV-Infektion ausschließlich an Position S272 verstärkt phosphoryliert wird. Der Phosphorylierungsstatus aller anderen, bekannten Phosphorylierungsstellen von SQSTM1/p62 wurde durch die HCMV-Infektion nicht beeinflusst. Um die Rolle der Phosphorylierung an S272 bei einer HCMV-Infektion näher zu untersuchen, wurden HCMV-Mutanten hergestellt, die verschiedene Versionen von SQSTM1/p62 exprimierten. So wurde ein Virus hergestellt, das den Rezeptor in seiner Wildtyp-Konfiguration (S272) exprimierte. Weitere Viren wurden kloniert, die eine Version von SQSTM1/p62 exprimierten, in der Serin durch Asparaginsäure oder Glutaminsäure ersetzt wurde (S272D und S272E). Eine derartige Modifikation ahmt die Phosphorylierung an Position S272 nach. Schließlich wurde ein Virus hergestellt, in dem Serin durch Alanin an Position S272 ersetzt wurde (S272A). Alanin kann nicht phosphoryliert werden. Die Bindung der verschiedenen Versionen des Rezeptors an das Cargo wurde in Ko-IP- und MS-Analysen nach Infektion von SQSTM1-Knockout-Zellen mit den rekombinanten Viren untersucht. Hierbei zeigten sich keine Unterschiede in der Bindungsfähigkeit von SQSTM1/p62 an zelluläre und virale Proteine. Die Phosphorylierung an S272 reduzierte jedoch den proteasomalen Abbau von SQSTM1/p62, was zu einer Anreicherung des Rezeptors und zu erhöhten ISG-Proteinspiegeln in HCMV-infizierten Zellen führte. Dies war von einer verringerten Freisetzung von Tochterviren begleitet. Obwohl SQSTM1/p62 also die ISG-Proteinkonzentration einschränkt, wie im ersten Teil der Arbeit festgestellt wurde, scheint die Phosphorylierung an S272 die IFN-I-Induktion zu verstärken. Die S272-Phosphorylierung scheint also ein entscheidender Faktor zu sein, der die Interferenz von SQSTM1/p62 und Autophagie bei IFN-I-Reaktionen reguliert.
Um festzustellen, ob die HCMV-Kinase pUL97 an der Phosphorylierung von SQSTM1/p62 an S272 beteiligt ist, wurde eine analog-sensitive Version dieser Kinase (pUL97-as1) verwendet. Das mutierte Gen (UL97-as1) exprimiert eine Version von pUL97, die durch Behandlung mit dem ATP-Analogon 3MB-PP1 spezifisch und reversibel gehemmt werden kann. Durch Ersetzen des wt-UL97-Gens durch UL97-as1 wurde ein rekombinantes HCMV erzeugt. Die Infektion von Zellen mit dieser Mutante in Gegenwart von 3MB-PP1 führte zur verminderten Phosphorylierung von SQSTM1/p62 an S272. Dies deutet darauf hin, dass pUL97 an der Phosphorylierung des Rezeptors beteiligt ist. Das Ergebnis konnte durch Ko-Transfektionsexperimente bestätigt werden. Eine In-vitro-Kinase-Analyse konnte jedoch keine direkte Phosphorylierung von SQSTM1/p62 durch pUL97 nachweisen, was auf eine indirekte Wirkung der viralen Kinase auf die Phosphorylierung des Rezeptors hinweist. Diese Ergebnisse waren überraschend, da die Experimente im vorangegangenen Abschnitt gezeigt hatten, dass die S272-Phosphorylierung die Produktion von HCMV-Tochterviren behindert. Es bleibt unklar, warum pUL97 eine antivirale Wirkung vermitteln sollte. Dies könnte jedoch durch die vielfältigen Funktionen der viralen Kinase zur Unterstützung der viralen Infektion erklärt werden, die zufälligerweise auch zur S272-Phosphorylierung durch eine zelluläre Kinase führen könnten. Weitere Experimente sind notwendig, um die Auswirkungen von pUL97 auf die Funktion von SQSTM1/p62 und auf die Autophagie zu untersuchen.
Neben SQSTM1/p62 wurde auch der Autophagierezeptor Optineurin und seine Rolle während einer HCMV-Infektion untersucht. Überraschenderweise konnte durch Ko-IP- und MS-Analysen nur ein HCMV-Protein, nämlich pUL84, als Bindepartner von Optineurin identifiziert werden. Interessanterweise interagierte pUL84 auch mit SQSTM1/p62. Da pUL84 eine Schlüsselkomponente des DNA-Replikationskomplexes ist, deutet dies auf eine mögliche Interferenz von Optineurin mit der viralen Genomreplikation hin. Die Infektion von Optineurin-Knockout-Zellen zeigte jedoch keine Beeinträchtigung der HCMV-Genomreplikation und der Freisetzung von Nachkommen. Weitere Analysen hierzu, z.B. in Bezug auf verschiedene Zelltypen, gehen über den Rahmen dieser Arbeit hinaus und sollen in weiteren Studien untersucht werden.
In einem weiteren Abschnitt wurde die Rolle von ausgewählten TRIMs während der HCMV-Infektion untersucht. TRIM25, TRIM26 und TRIM32 konnten wir in Vorarbeiten als Bestandteile von HCMV-Virionen identifizieren. TRIM21 und TRIM28 sind bekannte Regulatoren der Autophagie. Interessanterweise konnte in Ko-IP/MS-Analysen wiederum eine Interaktion einiger dieser TRIMs mit Kapsidproteinen nachgewiesen werden. Zur weiteren Analyse wurden individuelle Knockout-Zellen hergestellt. Der Knockout der TRIMs hatte keinen Einfluss auf die Induktion der Autophagie in HCMV-infizierten Zellen. Allerdings führte der Knockout insbesondere von TRIM25 und TRIM32 zu einer erhöhten Freisetzung von Tochterviren. Einige TRIMs scheinen also tatsächlich eine Funktion bei der zellulären Abwehr bei HCMV-Infektionen wahrzunehmen.
In einem letzten Abschnitt der Arbeit wurde die Rolle der immunity related GTPase Q (IRGQ) im Rahmen der HCMV-Infektion zusammen mit der Arbeitsgruppe von Lina Herhaus vom Institut für Biochemie II der Goethe-Universität Frankfurt am Main untersucht. Herhaus und Kollegen hatten IRGQ als einen neuen Regulator der Autophagie bei der Salmonella-Infektion identifiziert. Der Knock-down von IRGQ hatte keinen Einfluss auf die virale Genomreplikation. Interessanterweise führte jedoch der Knock-down dieses Proteins zu einer deutlich erhöhten Freisetzung viraler Nachkommen. Ein gleicher Effekt wurde auch nach dem Knock-down des Gamma-aminobutyric acid receptor-associated protein-like 2 (GABARAP-L2) beobachtet. Dieses Protein ist ein bekannter Bindungspartner von IRGQ. Die Ergebnisse haben außerdem gezeigt, dass die antivirale Wirkung von IRGQ von GABARAP-L2 abhängig ist. Zusammengefasst konnten diese Experimente IRGQ als einen neuen Regulator der HCMV-Infektion identifizieren. Der Mechanismus der antiviralen Wirkung von IRGQ muss in nachfolgenden Arbeiten adressiert werden.