Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-987
Authors: Bikar, Sven-Ernö
Title: Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung des Dmxl1-Gen in Mus musculus sowie die funktionelle Analyse durch Knock-Out
Online publication date: 29-Oct-2010
Year of first publication: 2010
Language: german
Abstract: Identifizierung, Sequenzierung und Charakterisierung des Dmxl1-Gen in Mus musculus sowie die funktionelle Analyse durch Knock-OutrnrnBei Dmxl1 handelt es sich um ein neuartiges Gen aus Mus musculus. Das ebenfalls in der vorliegenden Arbeit bioinformatisch untersuchte Gen DMXL1 ist das zu Dmxl1 homologe Gen des Menschen. Beide Gene bestehen aus 43 Exons, das murine Dmxl1 codiert für eine mRNA von 10992 bp bzw. 12210 bp, das humane DMXL1 kodiert für eine cDNA von 11082 bp, der offene Leserahmen umfasst bei der Maus 9042 bp. In der Maus konnte ein mögliches alternatives Polyadenylierungssignal identifiziert werden. Zwischen beiden Spezies sind die Exonpositionen und ihre Längen hoch konserviert. Dmxl1 liegt auf dem Crick-Strang von Chromosom 18 Bande C, der translatierte Bereich erstreckt sich auf genomischer Ebene über 129558 bp und die Orientierung verläuft in Richtung Centromer. Dmxl1 und DMXL1 gehören damit zu den größten bekannten Genen in Maus und Mensch. Bei beiden Spezies liegen die DmX-Homologen genomisch innerhalb eines Bereichs der Isochoren-Klasse L1 in einer Gen-armen Region. Die Anzahl der repetitiven Elemente innerhalb der Genregion von Dmxl1 liegt 6% unter dem erwarteten Wert eines L1 Isochors, die Anzahl beim Menschen liegt 4% über dem erwarteten Wert. Um die mögliche Promotorstruktur von Dmxl1 darzustellen, wurden umfangreiche in silico-Analysen der Region um den putativen Transkriptionsstart vorgenommen. Mit Hilfe der gewonnenen Daten konnte ein Transkriptionstartpunkt identifiziert werden. Zudem wurde eine Promotorstruktur erarbeitet, bei der angenommen werden kann, dass sie eine gute Näherung an die tatsächlich vorhandenen Bindungsstellen von Transkriptionsfaktoren darstellt. Die mit bioinformatischen Werkzeugen erzeugte virtuelle Promotor- und Enhancerstruktur zeigt das Potenzial, Dmxl1 basal und ubiquitär zu exprimieren. Gleichzeitig zeigen diese Daten, dass Dmxl1 vermutlich in einigen Geweben der Keimbahn, im Fettgewebe, dem blutbildenen System und während der Embryogenese hochkomplex reguliert werden kann. Eine regulierte Expression zur Steuerung des Energiestoffwechsels ist ebenfalls wahrscheinlich. Diese Ergebnisse passen sehr gut zu den experimentell ermittelten Daten und den beobachteten Phänotypen Dmxl1-chimärer Mäuse.rnDie abgeleitete Aminosäuresequenz umfasst in der Maus 3013 AS, im Menschen 3027 AS, der Vergleich der abgeleiteten Aminosäuresequenzen zeigt eine Identität von 89,3 % und eine Similarität von 94,7 % zwischen beiden Spezies. Im Dmxl1/DMXL1-Protein von Maus und Mensch konnten mindestens 24 und maximal 36 WD-Wiederholungseinheiten identifiziert werden, zudem wurden eine Reihe weiterer konservierter Proteinmotive gefunden. Die in silico-Strukturanalysen beider abgeleiteter Aminosäuresequenzen lässt vermuten, dass sich C- und N-terminal WD-Propellerstrukturen befinden. In dieser Arbeit gelang eine C-terminale Rekonstruktion einer 10-blättrigen Propellerstruktur, denkbar ist jedoch auch eine Struktur mit mindestens drei WD-Propellern, wenn eine prädominante Struktur mit Propellern aus jeweils sieben Propellerblättern angenommen wird.rnDas primäre Ziel dieser Arbeit, die Etablierung einer stabilen Mauslinie mit diruptiertem Dmxl1-Gen konnte aufgrund einer beobachteten Haploinsuffizienz nicht erreicht werden. Trotz zahlreicher Transformationen von Maus-Stammzelllinien konnte letztlich nur eine stabil transformierte Linie mit einem Dmxl1-Null-Allel identifiziert werden, was auch zu den theoretischen Daten und den angenommenen Aufgaben von Dmxl1 als komplex und diffizil reguliertes Multifunktions-Protein passt. Aus der transformierten Mauszelllinie konnten chimäre Mäuse entwickelt werden, die in Abhängigkeit von dem Ausmaß des Chimärismus phänotypisch massive Schädigungen aufwiesen. Neben einer Teilsterilität wurden massive Fettleibigkeit und ein ausgeprägter Hypogonadismus beobachtet. Keines der Tiere war in der Lage das Dmxl1-Null-Allel zu transduzieren. Die Tiere waren nur sehr eingeschränkt fertil, die wenigen Nachkommen entsprachen genotypisch und phänotypisch ausschließlich den verwendeten Blastocysten.rn
Identification, sequencing and characterization of the Dmxl1-gene from Mus musculus and functional analysis by knockoutrnDmxl1 is a novel gene from Mus musculus. The gene DMXL1 whichis also investigated in this thesis is the human homologue to Dmxl1. Both genes consist of 43 exons, the murine Dmxl1 encoding an mRNA of 10 992 bp and 12 210 bp respectively, the human DMXL1 encodes a mRNA of 11 082 bp, in the mouse the open reading frame comprises 9042 bp. A possible alternative polyadenylation signal could be identified for the murine Dmxl1. Exon positions and their lengths are highly conserved between both species. Dmxl1 is located on the Crick strand of chromosome 18, band C, the transcribed region spans on 129 558 bp at the genomic level with a centromeric orientation. Therefore Dmxl1 and DMXL1 belong to the largest genes known in mouse and human. In both species, the DMX-homologues are located within L1 isochores in a gene-poor region. The number of repetitive elements within the genomic region of Dmxl1 is 6% below the expected value of an L1 isochore, the number in humans is 4% above the expected value. In order to determine the potential promoter structure of Dmxl1, comprehensive in silico analyses of the genomic region around the putative transcriptional start site were performed. Based on the data obtained a potential transcriptional start site could be identified. In addition, a possible promoter and enhancer structure has been worked out which can be considered a good approximation to the actually existing binding sites of transcription factors. The identified promoter and enhancer structure has the capability of expressing Dmxl1 ubiquitous at a basal level. In Addition these data indicate that Dmxl1 can probably be regulated in a complex pattern in some tissues like germ line, adipose tissue, the hematopoietic system and during embryogenesis. A regulated expression for the control of energy metabolism is also likely. These results fit very well with the experimental data and the observed phenotypes of Dmxl1-chimeric mice. rnThe deduced amino acid sequence comprises 3013 aa in the mouse and 3027 aa in humans, respectively. The identity is 89.3% and the similarity is 94.7% between the two species on aa level. In the Dmxl1/DMXL1-protein of mouse and human at least 24 and a maximum of 36 WD-repeat units can be identified. Additionally, a number of other conserved protein motifs could be identified. In silico structural analyses of both amino acid sequences suggest that there are probably be some C-and N-terminal WD-propeller structures. In this thesis a bioinformatic based C-terminal reconstruction of a 10-bladed propeller structure could be performed by bioinformatic means.rnThe primary objective of this work, the establishment of a stable mouse line with a disrupted Dmxl1 gene could not be reached due to observed haploinsufficiency. Although numerous transformations have been performed, only one stable transformed mouse line with the Dmxl1 null allele could be identified. From this transformed mouse cell line a small number of chimeric mice could be developed showing partial sterility, massive obesity and a distinct hypogonadism. None of the animals was able to pass the Dmxl1 null allele to its offspring. The few progeny were genotypically and phenotypically equal to the used blastocysts.rn
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-987
URN: urn:nbn:de:hebis:77-24297
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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