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Authors: Stohr, Michael
Title: 3D- Cryo-Elektronenmikroskopie des 4x6-Hämocyanins der Vogelspinne Eurypelma californicum unter Oxy- und Deoxybedingungen
Online publishing date: 17-Apr-2007
Language : german
Abstract: Arthropodenhämocyanine und Molluskenhämocyanine, die extrazellulären Atmungsproteine der Arthropoden und Mollusken, unterscheiden sich grundsätzlich im Aufbau, besitzen aber ähnliche aktive Zentren, welche in ihrer oxydierten Form für die Blaufärbung der Hämocyanine verantwortlich sind. Sauerstoff wird im Bindungszentrum zwischen zwei, von sechs Histidinen ligandierten, Kupfer(I)Ionen gebunden. Arthropodenhämocyanine bauen sich artspezifisch aus 1, 2, 4, 6, oder 8 Hexameren mit D3-Symmetrie auf. Die Untereinheiten von je ca. 75 kDa falten sich in drei Domänen unterschiedlicher Funktionen. Der komplexe, hierarchische Zusammenbau der Arthropodenhämocyanine hängt von der Heterogenität der Untereinheiten ab. Die 7 verschieden Sequenzen des 4x6-Hämocyanins von Eurypelma californicum (EcHc) sind biochemisch in der Quartärstruktur lokalisiert. Bislang fehlte noch ein unabhängig erstelltes 3D-Modell der geometrischen Gesamtstruktur welche die hexamere und monomere Topographie eindeutig zeigt. Dessen Erstellung war Gegenstand dieser Arbeit, in Verbindung mit der Zielsetzung, die 3D-Rekonstruktion in den beiden extremen physiologischen Zuständen, mit und ohne gebundenen Sauerstoff, zu erzeugen. Dazu wurden in einer eigens entwickelten Atmosphären-Präparationskammer die Proteine in Lösung schockgefrorenen und mittels Cryo-3D-Elektronenmikroskopie gemessen. Aus den daraus gewonnen Projektionsbildern ließen sich mit der ”Single Particle Analyse“ die 3D-Informationen zurückberechnen. Die 3D-Rekonstruktionen wurden mit der publizierten Röntgenkristallstruktur des hexameren Referenz-Hämocyanins der Languste Panulirus interruptus verifiziert. Die Rekonstruktionen erlaubten die eindeutige Messung diverser in der Literatur diskutierter Parameter der Architektur des 4x6-EcHc und darüber hinaus weiterer geometrischer Parameter, welche hier erstmals veröffentlicht werden. SAXS-Daten sagen extreme Translationen und Rotationen von Teilquartärstrukturen zwischen oxy- und deoxy-EcHc voraus, was von den 3D-Rekonstruktionen der beiden Zustände nicht bestätigt werden konnte: Die 16 Å Rekonstruktion der Deoxyform weicht geometrisch nicht von der 21 Å Rekonstruktion der Oxyform ab. Die Einpassung der publizierten Röntgenstruktur der Untereinheit II des Hämocyanin des Pfeilschwanzkrebses Limulus polyphemus in die Rekonstruktionen unterstützt eine auf der hexameren Hierarchieebene lokalisierte Dynamik der Oxygenierung. Mittels Einpassung modellierter molekularer Strukturen der EcHc-Sequenzen konnte eine erste Vermutung zur Lokalisation der beiden zentralen Linker-Untereinheiten b und c des 4x6-Moleküls gemacht werden: Demnach würde Untereinheit b in den exponierten Hexameren des Moleküls liegen. Aussagen über die Quartärstrukturbindungen auf molekularer Ebene aufgrund der Einpassung modellierter molekularer Daten in die Rekonstruktionen sind als spekulativ einzustufen: a) Die Auflösung der Rekonstruktion ist verbesserungswürdig. b) Es gibt keine adäquate Vorlage für eine verlässliche Strukturvorhersage; die verschiedenen EcHc-Sequenzen liegen nur als Modellierung vor. c) Es wäre eine flexible Einpassung notwendig, um Ungenauigkeiten in den modellierten Strukturen durch Sekundärstrukturanpassung zu minimieren.
Arthropod hemocyanins and mollusc hemocyanins, the extracellular respiratory proteins of the arthropods and molluscs, differ in principle in the structure, but however possess similar active sites, which are responsible for the blue colour of the hemocyanins in their oxygenated form. Oxygen is bound at the binding site between two copper(I) ions which are carried by six Histidins. Arthropod hemocyanins are composed species specifically from 1, 2, 4, 6, or 8 hexamers with D3-symmetry. Those subunits, of each approx. 75 kDa, fold in three domains of different functions. The complex, hierarchical assembly of the arthropod hemocyanins depends on the heterogeneity of the subunits. The 7 different sequences of the 4x6-hemocyanin of Eurypelma californicum (EcHc) have been located biochemically within the quaternary structure. But up to now an independent 3D-modell of the geometrical total structure which clearly shows the hexameric and monomeric topography was missing. To crate this was the subject of this work, apart from the objective to produce the 3D reconstruction in its two extreme physiological conditions, with and without bound oxygen. Therefore the proteins in solution were shock-frozen inside a particularly developed atmosphere preparation chamber and measured by means of cryo 3D electron microscopy. From the resulting projection images the 3D information could be back-computed with single particle analysis. The 3D reconstructions were verified with the published X-ray crystallographic structure of the hexameric reference hemocyanin of the spiny lobster Panulirus interruptus. The reconstructions permitted the clear measurement of various parameters of the architecture of the 4x6-EcHc discussed in literature and beyond that, further geometrical parameters, which are published here for the first time. From SAXS data extreme translations and rotations of partial quaternary structures between oxy and deoxy EcHc have been predicted, which could not be confirmed by the 3D reconstructions of the two conditions: The 16 Å reconstruction of the deoxy form does not deviate geometrically from the 21 Å reconstruction of the oxy form. Fitting the published X-ray crystallographic structure of the subunit II of the hemocyanin of the horseshoe crab Limulus polyphemus into the reconstructions supports dynamics of oxygenation located to the hexameric hierarchy level. By means of fitting modelled molecular structures of the EcHc sequences a first assumption could be made concerning the localization of the two central linking subunits b and c of the 4x6-meric molecule: Therefore the b subunit lie in the exposed hexamers of the molecule. Statements about the bindings of the quaternary structure on molecular level due to fitting modelled molecular data into the reconstructions are to be classified as speculative: a) The resolution of the reconstruction has room for improvement. b) There is no adequate template for reliable structure prediction; the EcHc sequences are only modelled. c) A flexible fitting would be necessary, in order to minimize inaccuracies in the modelled structures by secondary structure adjustment.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-951
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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