Authors:	Bakhshandeh, Neda
Advisor:	Weber, Matthias M.
Title:	Investigation of blood-based biomarkers as prognostic and predictive factors in patients with neuroendocrine neoplasms
Online publication date:	12-Sep-2023
Year of first publication:	2023
Language:	english
Abstract:	The current study is being conducted to determine whether plasma cfDNA, cfDNA hypomethylation, cfDNA integrity index or quantitative concentrations of ALU 115-, ALU 260-, LINE-1 97-, LINE-1 266-bp fragments can be robust biomarkers for the diagnosis and prognosis of NENs. The aim is to establish a new biomarker for the diagnosis and follow-up of NEN patients on a molecular basis. This study evaluates the efficiency of these suggested biomarkers in different phases of NEN cancer and the association between each biomarker and clinicopathological tumor characteristics. Methods: The cfDNA plasma samples originated from 62 patients, aged (33-87), with pathologically confirmed NEN, and 29 control, aged (24-77) years, from neuroendocrine patients without neoplastic diseases were evaluated. Depending on the disease, the patients were categorized into different groups to 47 patients with the metastatic NET disease (mNET), 8 nonmetastatic NET disease (non-mNET), and 7 NEC disease. Here, we examined the cfDNA plasma concentration, concentration of long and short cfDNA fragments measured via ALU and LINE-1 repetitive DNA elements, cfDNA integrity, and cfDNA hypomethylation. The integrity index was calculated using: the ALU 266/115 ratio and the LINE-1 266/97 ratio, based on the data obtained by real-time PCR. The cfDNA hypomethylation was assessed based on the methylation status of ALU and was considered representative of the global hypomethylation status. The discriminatory power of each logistic model was investigated using the area under the ROC curve (AUC). Results: cfDNA biomarker: NEN Patients, showed a higher, but not significant increase of cfDNA concentration in comparison to healthy controls. Dividing the study patients’ group to non-metastatic NET (none- mNET), metastatic NET (mNET) and NEC patients, a significant increase for mNET could be detected. Further analysis revealed, the more advanced the NEN disease, the higher the cfDNA level, leading to significant differences for controls to patients with a G3 tumor or a significant increase for patients with a moderate or high tumor burden. ROC curve for discriminating patients with grade 3(G3) NENs from healthy subjects had an AUC of 0.80 (at 50% sensitivity and 100% specificity). The ROC curve for discriminating patients with moderate and high tumor burden displayed an AUC of 0.77 and for patients with high tumor burdens an AUC of 0.84 (at 75% sensitivity and 97.4% specificity). The analysis confirmed higher cfDNA levels in patients were associated with an increased risk of death. The patients with lung tumor origin had a higher quantity of cfDNA than patients with a primary tumor of the ileum. Fragment sizes biomarker: No significant difference was observed in levels of short and langer fragments between groups, but a significant decrease in ALU 260-bp fragment level was detected in samples with no tumor compared to large tumor burdens. ROC curve analysis showed a good distinguish accuracy between these two groups (AUC: 0.81, 100% sensitivity, and 52.6% specificity). cfDNA integrity index (cfDII) biomarker: We did not find any significant differences regarding ALU cfDII between the groups. In contrast, the LINE-1 cfDII was significantly decreased in plasma of NEN patients compared to healthy control, but it showed a low accuracy in ROC analysis (AUC=0.67). For LINE-1 cfDII, we could see in the more advanced the NEN disease, the lower the LINE-1 cfDII, leading to a good discriminatory AUC of 0.80 (at 90% sensitivity and 69% specificity) for G3 classified tumors or an AUC of 0.83 (at 87.5% sensitivity and 71% Summary 98 specificity) for patients with a high tumor burden to healthy controls. In addition, a lower LINE-1 cfDII was observed in patients with primary tumors in the small intestine than in patients with the primary tumor in the ileum. ALU hypomethylation biomarker: Significant higher hypomethylation was observed in patients with mNETs than patients with non mNETs, with a sensitivity of 87.5% at 79.6%% specificity and an AUC of 0.87. Regarding tumor grade and tumor burden, the more advanced the disease, the higher was the measured hypomethylation level. A great discriminatory accuracy was calculated between patients with a high tumor burden and healthy or cured patients (AUC: 0.96; at 100% sensitivity and 86.8% specificity). A positive correlation between hypomethylation and CgA levels was detected. Combined biomarkers: With the multiparametric ROC curve analysis including cfDNA, hypomethylation, and CgA level as a biomarker, a great diagnostic accuracy between patients with mNET and NEC to patients with non-mNET could be calculated with 66.67% positive predictive and 90.91% negative predictive values (AUC:0.91). Conclusion: Current findings support the role of the tested biomarkers for prognosis, progressive and predictive, but not a diagnostic. The combination of tested biomarkers contributes to better efficiency relative to the single-use them. The novel biomarkers can be valuable biomarkers for the management of patients, optimal treatment, and open new therapy views correlated with sickness course. ALU hypomethylation was the most promising molecular marker that would be useful in monitoring patients for disease progression. However, these potential molecular biomarkers need clinical confirmation and more validation to use as a non-invasive tool for routine monitoring in a clinical setting. In der aktuellen Studie wurde die Eignung von Plasma-cfDNA, cfDNA-Hypomethylierung, cfDNA-Integritätsindex oder quantitative Konzentrationen von ALU 115-, ALU 260-, LINE-1 97-und LINE-1 266-bp-Fragmenten, als robuste Biomarker für die Diagnose und Prognose von Neuroendokrinen Neoplasien (NEN) untersucht. Die Studie bewertet die Effizienz dieser möglichen Biomarker- Kandidaten in verschiedenen Tumorstadien und den Zusammenhang zu den klinisch-pathologischen Eigenschaften der Patienten. Ziel ist die Etablierung eines neuen Biomarkers für die Diagnostik und Nachsorge von NEN-Patienten auf molekularer Basis. Methoden: Plasmaproben von 62 Patienten im Alter (33-87) mit pathologisch bestätigter NEN und 29 Kontrollproben im Alter (24-77) Jahre von neuroendokrinen Patienten ohne neoplastische Erkrankungen wurden entnommen. Die Einteilung der Patienten erfolgt anhand ihres Krankheitsbildes in folgende Gruppen: 47 Patienten mit metastasierter NET Erkrankung (mNET), 8 nicht metastasierte NET-Erkrankung (non-mNET) und 7 NEC Erkrankung. Untersucht wurden die cfDNA-Plasmakonzentration, die Konzentration von langen und kurzen cfDNA-Fragmenten, gemessen über ALU- und LINE-1-repetitiven DNA Elementen, die cfDNA-Integrität und die cfDNA-Hypomethylierung. Basierend auf den erhalten PCR-Daten wurde der Integritätsindex jeweils anhand dem Verhältnis von ALU 266 zu ALU 115 und dem Verhältnis von LINE-1 266 zu LINE-1 97 berechnet. Die cfDNA Hypomethylierung wurde anhand des Methylierungsstatus von ALU bewertet und als repräsentativ für den globalen Hypomethylierungsstatus angesehen. Die Trennschärfe jedes logistischen Modells wurde anhand einer ROC-Kurve, über die AUC (Area under the curve) ausgewertet. Ergebnisse: cfDNA-Konzentration: NEN Patienten zeigten eine Erhöhung der cfDNA Konzentration im Vergleich zu gesunden Kontrollen (nicht sigifikant). Unterteilt man die Studienpatienten in nicht metastasierte NET (kein-mNET), metastasierte NET (mNET) und NEC-Patienten, konnte ein signifikanter Anstieg für mNET festgestellt werden. Weitere Analysen ergaben, dass der cfDNA-Spiegel mit dem Fortschreiten der NEN-Krankheit steigt. Es konnten signifikante Unterschiede zwischen Kontrollen und Patienten mit NEN Tumor Grad 3 (G3) bzw. ein signifikanter Anstieg bei Patienten mit mittlerer oder hoher Tumorlast gezeigt werden. Patienten mit NEN G3 konnten von gesunden Probanden in der ROC Analyse mit einem AUC von 0,80 unterschieden warden (bei 50% Sensitivität und 100% Spezifität). Für Patienten mit mittlerer und hoher Tumorlast konnte ein AUC von 0,77 und für Patienten mit hoher Tumorlast eine AUC von 0,84 ermittelt warden (bei 75% Sensitivität und 97.4% Spezifität). Die Analyse bestätigte, dass höhere cfDNA-Spiegel mit einem erhöhten Sterberisiko bei NEN Patienten verbunden sind. Patienten mit Primärtumor der Lunge hatten eine höhere cfDNA Konzentration, als Patienten mit einem Primärtumor des Ileums. cfDNA Fragmentenlänge: Zwischen den Gruppen wurde kein signifikanter Unterschied in der Menge kurzer und langer LINE-1 Fragmente beobachtet. Patienten zeigten eine signifikant niedrigere ALU-260-bp-Fragmentmenge im Vergleich zur Kontrollgruppe, mit einer Trennschärfe von AUC 0,81 (bei 100% Sensitivität und 52,6% Spezifität). cfDNA Integritätsindex (cfDII): Wir fanden keine signifikanten Unterschiede bezüglich ALU cfDII zwischen den Gruppen. Im Gegensatz dazu war LINE-1 cfDII im Plasma von NEN-Patienten, verglichen zur gesunden Kontrollgruppe, signifikant erniedrigt, zeigte jedoch eine geringe Genauigkeit in der ROC-Analyse (AUC:0,67). Je weiter fortgeschritten die NEN-Krankheit, desto niedriger ist die LINE-1 cfDII, was zu einer guten Trennschärfe in der ROC-Kurve führt Summary 100 (AUC:0,80 für Tumorgrad G3 - Kontrollen bei 90% Sensitivität und 69% Spezifität / AUC:0,83 bei 87,5% Sensitivität und 71% Spezifität für hohe Tumorlast – Kontrollen). Darüber hinaus wurde bei Patienten mit Primärtumor im Dünndarm ein niedrigerer LINE-1 cfDII beobachtet, als bei Patienten mit Primärtumor im Ileum. ALU-Hypomethylierung: Bei Patienten mit mNETs wurde eine signifikant höhere Hypomethylierung beobachtet als bei Patienten mit Nicht-mNETs, mit einer Sensitivität von 87,5% bei einer Spezifität von 79,6%% und einer gemessenen AUC von 0,87. Bezüglich Tumorgrad und Tumorlast war die gemessene Hypomethylierung umso höher, je weiter die Erkrankung fortgeschritten war. Es wurde eine hohe Trennschärfe zwischen Patienten mit hoher Tumorlast und gesunden bzw. geheilten Patienten berechnet (AUC: 0,96 bei 100% Sensitivität und 86,8% Spezifität). Es wurde eine positive Korrelation zwischen Hypomethylierung und CgA-Spiegeln festgestellt. Kombinierte Biomarker: Anhand multiparametrischer ROC-Kurvenanalyse, mit cfDNA, Hypomethylierung und CgA-Spiegel als Biomarker, konnte eine hohe diagnostische Genauigkeit zwischen Patienten mit mNET und NEC zu Patienten mit Nicht-mNETs mit 66,67 % positiven prädiktiven und 90,91 % negativen prädiktiven Werten berechnet werden (AUC:0,91). Schlussfolgerung: Aktuelle Erkenntnisse unterstützen die Rolle der getesteten Biomarker für die Prognose, Progredienz und Prädiktion, aber nicht für die Diagnose. Die Kombination der getesteten Biomarker trägt zu einer besseren Effizienz im Vergleich zu den Einwegmarkern bei. Die neuartigen Biomarker können wertvolle Biomarker für das Patientenmanagement und die optimale Behandlung sein und neue, mit dem Krankheitsverlauf korrelierte Therapieperspektiven eröffnen. ALU-Hypomethylierung war der vielversprechendste molekulare Marker, der sich zur Überwachung der Patienten hinsichtlich einer Progression der Erkrankung eignen würde. Weitere klinische Bestätigung und genauere Validierung sind nötig, um diese potenziellen molekularen Biomarker als nicht-invasives Werkzeug für die routinemäßige Überwachung in einer klinischen Umgebung anwenden zu können.
DDC:	610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-9460
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-a5b264a0-8e0d-4823-91b5-87fb0174b7520
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	VI, 120 Seiten ; Illustrationen, Diagramme
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