Authors:	Kaltwasser, Marcus
Title:	Untersuchungen zur selektiven Deletion alloreaktiver Spender-T- Lymphozyten durch CD178-modifizierte dendritische Zellen im Rahmen der allogenen Blutstammzelltransplantation
Online publication date:	14-Mar-2007
Year of first publication:	2007
Language:	german
Abstract:	Eine der häufigsten Komplikationen bei der allogenen Blutstammzelltransplantation stellt die Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung (Graft versus Host Disease, GvHD) dar. Sie wird durch allogene Spender-T-Lymphozyten verursacht, die Gewebe des Transplantatempfängers erkennen und inflammatorische Entzündungsprozesse auslösen. Neben dieser Alloreaktivität induzieren Spender-T-Lymphozyten jedoch auch immuntherapeutisch erwünschte Transplantat-gegen-Leukämie-Reaktionen (Graft versus Leukemia, GvL-Reaktion), bei denen residuelle Tumor- bzw. Leukämiezellen im Patienten durch Spender-T-Zellen spezifisch erkannt und eliminiert werden. Im Rahmen einer verbesserten Immmuntherapie wird daher versucht, GvHD-reaktive und GvL-reaktive Spender-T-Lymphozyten effizient voneinander zu separieren und so eine wirkungsvolle GvHD-Prophylaxe bzw. optimierte GvL-Induktion zu erreichen. In diesem Kontext war es Ziel dieser Arbeit, murine dendritische Zellen (DZ) so zu modifizieren, daß sie für die spezifische Deletion alloreaktiver T-Zellen in murinen GvHD/GvL-Tiermodellen eingesetzt werden können. Die Modifikation der DZ sollte dazu führen, daß über das CD95/CD178-System Aktivierungs-induzierter Zelltod (activation induced cell death, AICD) in alloreaktiven T-Zellen ausgelöst wird. Hierzu wurden für die Modifikation der DZ zwei verschiedene Mechanismen angewandt: a) die Transfektion der DZ mit CD178-mRNA sowie b) die zielgerichtete Immobilisierung von hCD178-X-Fusionsproteinen auf Oberflächenmolekülen von DZ bzw. T-Zellen. Als Positivkontrolle für die Induktion CD95-vermittelter Apoptose diente der agonistische anti-CD95-Antikörper Jo2. Bei der Transfektion muriner DZ mit mRNA zeigte sich anhand des Reportergens EGFP, daß aus dem Knochenmark generierte DZ mit hoher Effizienz mit EGFP-mRNA transfizierbar waren. Im Falle von hCD178-mRNA führte die Transfektion jedoch zu einer insuffizienten CD178-Expression, die mit den regulatorischen Eigenschaften der zytoplasmatischen CD178-Region in Verbindung gebracht werden konnte. So führte die Verwendung einer zytoplasmatisch trunkierten Form der CD178-mRNA (CD178Dzyt) zu einer durchflußzytometrisch nachweisbaren CD178-Expression in DZ. Mit diesen CD178Dzyt-exprimierenden DZ konnte in einem Proliferationstest die Proliferation alloreaktiver T-Zellen inhibiert werden. Die Beladung von DZ bzw. von T-Zellen mit hCD178-X-Fusionsproteinen führte in vitro ebenfalls zu einer deutlichen Reduktion von Alloreaktivität. Dabei konnte eine spezifische Deletion/Inhibition alloreaktiver T-Zellen nachgewiesen werden. Die Elimination alloreaktiver T-Zellen erfolgte in beiden Verfahren über AICD. Darüber hinaus wurde eine Bifunktionalität der Fusionsproteine festgestellt, da sie neben der Induktion CD95-vermittelter Apoptose auch in der Lage waren, die Kostimulation allogener T-Zellen effizient zu inhibieren. Mit Hilfe adoptiver T-Zell-Transferexperimente konnten abschließend die in vitro gewonnenen Ergebnisse in vivo in zwei verschiedenen GvHD-Mausmodellen bestätigt werden. Graft-versus-host (GvH) disease (GvHD) represents a major caveat in allogeneic hematopoietic blood stem cell transplantation (AHSCT) and commonly leads to severe morbidity and mortality in AHSCT patients. GvH-reactivity and pathogenesis of the disease is mainly mediated by alloreactive T lymphocytes present in the donor graft which attack host tissues and initiate inflammatory processes. In addition, donor T cells recognize HLA- and Minor-histocompatibility-molecules different between donor and recipient as well as leukemia-associated antigens and thus induce antileukemic immune responses to combat residual tumor or leukemia cells. These beneficial and immunotherapeutically desired allogeneic T cell reactivity is termed graft-versus-leukemia (GvL) effect. In order to improve adoptive immunotherapy the development of effective strategies to achieve separation of GvH-and GvL-immunity by selective depletion of alloreactivity while harnessing GVL-specific donor T cells is of central interest in AHSCT. The objective of this work was to deploy murine bone marrow (BM) derived dendritic cells (DC) as most potent stimulator cells of GvH-reactivity for elimination of alloreactivity in murine MHC-disparate GvHD/GvL models. Two different approaches were used: a) transfection of DC with hCD178-mRNA and b) cell surface restricted targeting of chimeric hCD178-X fusion proteins onto costimulatory molecules present on DC or T cells. These ex vivo modifications of DC should lead to selective depletion of alloreactive specificities by inducting activation induced cell death (AICD) via the CD95/CD178 pathway in GvH-reactive donor T cells. As a positive control for the induction of CD95 mediated apoptosis the agonistic anti CD95 antibody Jo2 was applied. DC generated in vitro from murine BM and transfected with EGFP-mRNA showed high EGFP-expression levels and transfection efficacy, whereas insufficient CD178 expression was observed after hCD178-mRNA transfection. This was found to be due to regulatory properties of the cytoplasmatic region of CD178 as a cytoplasmic truncated form of hCD178-mRNA (hCD178Dcyt) resulted in clearly detectable CD178 expression. In addition, proliferation of alloreactive T cells could be significantly inhibited by these CD178Dcyt expressing DC. Moreover, loading of hCD178-X fusion proteins such as hCD178-mCD28 or hCD178-hRANK onto DC or T cells, respectively, led to reduction of alloreactivity in vitro. This depletion/inhibition of alloreactive T cells could be shown to be specific for given alloantigen(s) and was mediated by AICD. Additionally, CD178-X fusionproteins were found to block costimulation of T cells upon binding and thus represent chimeric proapoptotic molecules with bifunctional properties. Finally, the in vitro results described could be confirmed in vivo in two different GvHD mouse models by adoptive T cell transfer experiments.
DDC:	610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-944
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-12818
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:	JGU-Publikationen