Use of genome editing in human phagocytic cells to elucidate the role of the NLRP3 inflammasome in L. major infection
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Leishmaniose ist eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die von protozoischen Parasiten der Gattung Leishmania (L.) verursacht wird. Der Parasit hat einen digenetischen Lebenszyklus mit einer promastigoten Form im Sandmückenvektor und einer amastigoten Form im Säugetierwirt. Der Biss der infizierten Sandmücke überträgt die Promastigoten in die Haut des Wirtes. Die Parasiten infizieren hier Makrophagen als finale Wirtszelle. Um die Infektion aufrecht zu erhalten und zu verbreiten, müssen Leishmanien Zyklen von Wirtszellaustritt und Neuinfektion durchlaufen. In vivo Studien haben gezeigt, dass L. major pro-inflammatorische Monozyten als Reservoir zur Replikation nutzt. Dies geht mit einer anhaltenden Expression von IL-1β einher, was auf eine Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms hindeutet. Daher lautete meine Hypothese, dass auch das humane NLRP3 Inflammasom durch eine Leishmanieninfektion aktiviert wird und durch seinen Downstream-Mechanismus, Pyroptose zur Ausbreitung von Parasiten auf neue Wirtszellen beiträgt. Um die Probleme, die mit einer genetischen Veränderung von primären humanen Makrophagen (hMDM) verbunden sind, zu umgehen, habe ich die transdifferenzierende Zelllinie BLaER1 auf ihre Eignung als Modell für die Infektion von Makrophagen mit L. major untersucht. L. major infizierte, aktivierte und replizierte in BLaER1 Zellen ähnlich wie in hMDM. Ich benutzte dieses Infektionsmodell, um die Aktivierung des humanen Inflammasoms durch L. majorzu charakterisieren. L. major aktivierte das humane NLRP3 Inflammasom in Abhängigkeit von der Produktion phagolysosomaler reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und der Präsenz von LPG auf der Parasitenoberfläche. Im Gegensatz zu murinen Makrophagen führte die Inflammasomaktivierung nicht zu einer Restriktion der intrazellulären Parasiten. Um die Rolle der Pyroptose als Mechanismus der Ausbreitung on L. major aufzuklären, stellte ich zunächst fest, dass
BLaER1 GSDMD-/- Zellen eine erhöhte Pyroptoseresistenz im Vergleich zu BLaER1 Zellen besitzen und damit einhergehend eine stark verzögerte Parasitenfreisetzung aufweisen. Durch den Einsatz dieser Zelllinie in einem Koinkubationsexperiment, konnte ich zeigen, dass Beeinträchtigung des Pyroptosesignalwegs zu einer verminderten Parasitenausbreitung auf neue Wirtszellen führte. Dies bestätigt, dass Pyroptose ein möglicher Austrittsmechanismus von L. major in pro-inflammatorischen Mikroumgebungen ist. Insgesamt hat diese Arbeit gezeigt, dass BLaER1 ein vielversprechendes Zelllinienmodel für die Erforschung von Wirts-Pathogen-interaktionen von hMDM und L. major ist. Die, in dieser Arbeit demonstrierten, speziesspezifischen Unterschiede in der NLRP3 Inflammasomantwort sind bedeutend für die Entwicklung von Inflammasom-spezifischen Medikamenten. Darüber hinaus, zeigen die Ergebnisse, dass eine Erforschung pro-inflammatorischer Zelltodformen in der Pathogenese
der Leishmaniose nötig ist.