Authors:	Volkmar, Kerren
Title:	Use of genome editing in human phagocytic cells to elucidate the role of the NLRP3 inflammasome in L. major infection
Online publication date:	3-Aug-2023
Year of first publication:	2023
Language:	english
Abstract:	Leishmaniose ist eine vernachlässigte Tropenkrankheit, die von protozoischen Parasiten der Gattung Leishmania (L.) verursacht wird. Der Parasit hat einen digenetischen Lebenszyklus mit einer promastigoten Form im Sandmückenvektor und einer amastigoten Form im Säugetierwirt. Der Biss der infizierten Sandmücke überträgt die Promastigoten in die Haut des Wirtes. Die Parasiten infizieren hier Makrophagen als finale Wirtszelle. Um die Infektion aufrecht zu erhalten und zu verbreiten, müssen Leishmanien Zyklen von Wirtszellaustritt und Neuinfektion durchlaufen. In vivo Studien haben gezeigt, dass L. major pro-inflammatorische Monozyten als Reservoir zur Replikation nutzt. Dies geht mit einer anhaltenden Expression von IL-1β einher, was auf eine Aktivierung des NLRP3 Inflammasoms hindeutet. Daher lautete meine Hypothese, dass auch das humane NLRP3 Inflammasom durch eine Leishmanieninfektion aktiviert wird und durch seinen Downstream-Mechanismus, Pyroptose zur Ausbreitung von Parasiten auf neue Wirtszellen beiträgt. Um die Probleme, die mit einer genetischen Veränderung von primären humanen Makrophagen (hMDM) verbunden sind, zu umgehen, habe ich die transdifferenzierende Zelllinie BLaER1 auf ihre Eignung als Modell für die Infektion von Makrophagen mit L. major untersucht. L. major infizierte, aktivierte und replizierte in BLaER1 Zellen ähnlich wie in hMDM. Ich benutzte dieses Infektionsmodell, um die Aktivierung des humanen Inflammasoms durch L. majorzu charakterisieren. L. major aktivierte das humane NLRP3 Inflammasom in Abhängigkeit von der Produktion phagolysosomaler reaktiver Sauerstoffspezies (ROS) und der Präsenz von LPG auf der Parasitenoberfläche. Im Gegensatz zu murinen Makrophagen führte die Inflammasomaktivierung nicht zu einer Restriktion der intrazellulären Parasiten. Um die Rolle der Pyroptose als Mechanismus der Ausbreitung on L. major aufzuklären, stellte ich zunächst fest, dass BLaER1 GSDMD-/- Zellen eine erhöhte Pyroptoseresistenz im Vergleich zu BLaER1 Zellen besitzen und damit einhergehend eine stark verzögerte Parasitenfreisetzung aufweisen. Durch den Einsatz dieser Zelllinie in einem Koinkubationsexperiment, konnte ich zeigen, dass Beeinträchtigung des Pyroptosesignalwegs zu einer verminderten Parasitenausbreitung auf neue Wirtszellen führte. Dies bestätigt, dass Pyroptose ein möglicher Austrittsmechanismus von L. major in pro-inflammatorischen Mikroumgebungen ist. Insgesamt hat diese Arbeit gezeigt, dass BLaER1 ein vielversprechendes Zelllinienmodel für die Erforschung von Wirts-Pathogen-interaktionen von hMDM und L. major ist. Die, in dieser Arbeit demonstrierten, speziesspezifischen Unterschiede in der NLRP3 Inflammasomantwort sind bedeutend für die Entwicklung von Inflammasom-spezifischen Medikamenten. Darüber hinaus, zeigen die Ergebnisse, dass eine Erforschung pro-inflammatorischer Zelltodformen in der Pathogenese der Leishmaniose nötig ist. Leishmaniasis is a neglected tropical disease caused by protozoan parasites of the Leishmania (L.) genus. The parasite has a digenetic life cycle with a promastigote form in the phlebotomine sand fly and an amastigote form in the mammalian host. Upon inoculation of Leishmania ssp. into the mammalian host skin during a sandfly’s blood meal, the parasite infects human macrophages, its definite host cell. In order to sustain and propagate infections, the parasites have to complete cycles of exit from its host cells and re-infection of previously uninfected cells. Recent in vivo studies reported pro-inflammatory monocytes as replicative niche of L. major and showed prolonged expression of IL-1β at the infection site, indicating an activation of the NLRP3 inflammasome. Therefore, I hypothesized that L. major infection activates the human NLRP3 inflammasome and promotes parasite spreading via its downstream effector mechanism pyroptosis. To overcome limitations associated with the use of reverse genetic methods in human primary macrophages, I characterized the transdifferentiating cell line BLaER1 as a model for L. major infection. I found that Leishmania can infect, activate, and develop in BLaER1 macrophages similar as they can do in primary human macrophages. Utilizing this infection model, BLaER1 cells were used to investigate the role of the human inflammasome in the innate immune response to L. major. NLRP3 inflammasome activation by L. major was confirmed and found to be dependent on phagolysosomal ROS production and presence of LPG on the parasite surface. In contrast to murine macrophages, infection-dependent inflammasome activation in BLaER1 did not result in parasite restriction. To elucidate the role of pyroptosis in the spread of L. major parasites to new host cells, I first found that BLaER1 GSDMD-/- cells, which carry a deletion of the pore forming protein gasdermin D, are more resistant to pyroptotic cell death and, concomitantly, display a strongly delayed release of intracellular parasite. Using this knockout in a co-incubation assay in comparison with wild type BLaER1 cells, I demonstrate that impairment of the pyroptosis pathway leads to lower rates of parasite spread to new host cells, thus, implicating pyroptotic cell death as a possible exit mechanism of L. major in pro-inflammatory microenvironments. In summary, this thesis showed that BLaER1 cells are a promising cell line model for investigation of host-pathogen interactions of human macrophages and L. major. Moreover, it discovered species-specific differences in the NLRP3 inflammasome response, which are highly relevant for the development of inflammasome-targeting drugs. Furthermore, it makes a strong case for the investigation of pro-inflammatory forms of cell death in the pathogenesis of leishmaniasis
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-9321
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-06f43972-240a-4e70-bb3a-a4b1b995a6a44
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	CC BY
Information on rights of use:	https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Extent:	184 Seiten ; Illustrationen, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen