Authors:	Wöll, Stefan
Title:	Entstehung und Dynamik des Keratinfilament-Netzwerks
Online publication date:	12-Jan-2007
Year of first publication:	2007
Language:	german
Abstract:	Das zytoplasmatische Zytoskelett besteht aus drei Filamentsystemen, die aus Aktin, Tubulin und Intermediärfilamentproteinen aufgebaut sind und dreidimensionale Netzwerke ausbilden. Das Intermediärfilamentsystem, dem vor allem mechanische Stabilisierungsfunktionen zugesprochen werden, unterscheidet sich von den anderen durch seine Fähigkeit, spontan aus seinen Polypeptiduntereinheiten ohne weitere Kofaktoren zu polymerisieren und durch seinen unpolaren Aufbau. Es ist bis heute unbekannt, wie Intermediärfilamentnetzwerke in vivo moduliert werden und wie ihre Anordnung in den Kontext des Gesamtzytoskeletts koordiniert wird. Am Beispiel der epithelialen Intermediärfilamentproteine, den Keratinen, sollte daher untersucht werden, wie und wo neue Intermediärfilamente entstehen, welche Bedeutung den anderen Filamentsystemen bei dem Netzwerkaufbau und –Turn-Over zukommen und wie die Netzwerkbildung gesteuert wird. Zur Beantwortung dieser Fragestellungen wurden Zellklone hergestellt, die fluoreszierende Keratine synthetisieren. In der Zelllinie SK8/18-2, deren gesamtes Netzwerk aus derartigen Chimären aufgebaut ist, konnten anhand von mikroskopischen Zeitrafferaufnahmen der Fluoreszenzmuster Keratinfilamentvorläufer (KFP) identifiziert und deren Dynamik direkt in lebenden Zellen verfolgt werden. Es konnte gezeigt werden, dass die KFP in einem Plasmamembran-nahen Bereich entstehen, in dem sie zuerst als punktförmige Partikel detektiert werden. Nach einer initialen, sphäroidalen Wachstumsphase elongieren die Partikel zu kleinen Filamentstückchen. Diese können miteinander fusionieren und werden über ihre Enden in das periphere Netzwerk integriert. Der Wachstumsprozess ist gekoppelt an eine kontinuierliche, langsame Bewegung in Richtung auf das Zellzentrum. Diese Motilität sistiert vollständig nach pharmakologisch induziertem Abbau der Aktinfilamente. In Zeitraffer-aufnahmen kann jedoch in derartig behandelten Zellen ein wesentlich schnellerer Transport, der in verschiedene Richtungen verläuft und durch lange Ruhephasen unterbrochen wird, beobachtet werden. Dieser Modus, der gelegentlich auch in unbehandelten Zellen gefunden wurde, ist abhängig von intakten Mikrotubuli. Erst durch Zerstörung der Aktinfilamente und der Mikrotubuli erlischt die Motilität der KFPs vollständig. Bei der Suche nach Regulatoren der Keratinnetzwerkbildung wurde die p38 MAPK als zentraler Faktor identifiziert. Erstmals konnte eine direkte räumliche und zeitliche Korrelation zwischen einer spezifischen Enzymaktivität durch Nachweis der phosphorylierten p38 MAPK, der daraus folgenden Phosphorylierung eines Keratins, hier Serin 73 des Keratin 8, und der daraus resultierenden Veränderung des Netzwerkaufbaus, d. h. der Ausbildung von Keratingranula, nachgewiesen werden. Diese koordinierten Veränderungen wurden in unterschiedlichen Stresssituationen in verschiedenen Zellsystemen und in Zellen mit mutierten Keratinen beobachtet. Genetische (shRNA) und pharmakologische Manipulationen der p38 MAPK-Aktivität deuten auf einen engen kausalen Zusammenhang hin. The cytoplasmic cytoskeleton consists of three major filament-systems. The actin-, microtubule- and intermediate filament-system, which form three-dimensional networks in the eukaryotic cell. The intermediate filament system differs from the two other cytoskeletal components by its ability to polymerize spontaneously and by its non-polar assembly. In vitro, intermediate filaments are formed from polypeptide-subunits without participation of any cofactors. In vivo the modulation and assembly of the intermediate filament system is still unknown. The same is true for its integration in context of the other two cytoskeletal systems. To elucidate the contribution of actin filaments and microtubules to the motile properties, the assembly of the intermediate filaments and to study the regulation of the IF-system, fluorescent epithelial keratin polypeptides were introduced into non-epithelial, adrenal cortex-derived SW13 cells. Time-lapse fluorescence microscopy of stably transfected SK8/18-2 cells revealed extended filament networks that are entirely composed of transgene products and exhibit the same dynamic features as keratin systems in epithelial cells. Detailed analyses of living cells identified short keratin filament precursor (KFP). By monitoring the dynamic of these KFP, the cell periphery close to the plasmamembrane was determined as the place of their formation. In a first step of the KFP development small keratin granules originate in close proximity to the plasma membrane and move toward the cell centre in a continuous motion while elongating into flexible rod-like fragments which fuse with each other and integrate into the peripheral KF network. Pharmacological induced disruption of the actin filaments inhibited the continuous motion of the KFP and revealed a faster, microtubule dependent form of the KFP transport. The combined disruption of actin filaments and microtubules resulted in a complete block of KFP motility. With the search for regulators of the keratin network formation the p38 MAPK was identified as a central factor. For the first time a direct spatial and temporal correlation could be proved between a specific enzyme activity (p38 MAPK), the following phosphorylation of keratins (keratin 8 serine 73) and the resulting change of the intermediate filament network organisation. These co-ordinated changes were observed in different stress situations, in different cell systems and in cells with mutant keratins. Genetic (shRNA) and pharmacological manipulations of the p38 MAPK activity point to a narrow causal connection.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-911
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-12416
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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