Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-904
Authors: Barleben, Leif
Title: Kristallisation der Arbutin-Synthase und der Strictosidin Glukosidase - zwei Enzyme aus dem sekundären Glykosidstoffwechsel von Rauvolfia serpentina
Online publication date: 12-Jan-2007
Language: german
Abstract: Kristallisation der Arbutin-Synthase und der Strictosidin Glukosidase - zwei Enzyme aus dem sekundären Glykosidstoffwechsel von Rauvolfia serpentina Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Kristallisation und der strukturellen Auswertung der Arbutin-Synthase (AS) und der Strictosidin Glukosidase (SG). Beide Enzyme stammen aus der Medizinalpflanze Rauvolfia serpentina. Für die Kristallisation der Arbutin-Synthase wurden ca. 2500 verschiedene Beding-ungen experimentell untersucht. Für einige dieser Experimente wurde das Enzym molekularbiologisch und chemisch verändert. Trotzdem konnten keine Kristalle erhalten werden. Die bei diesen Veränderungen erhaltenen Ergebnisse wurden anhand von Vergleichen mit Strukturen anderer Glykosyltransferasen der gleichen Familie analysiert. Bei der Reinigung der AS konnte mit verschiedenen Trennsystemen nie eine homogene Lösung produziert werden. Der wahrscheinliche Grund für diese schlechte Isolierbarkeit, und damit der wahrscheinliche Grund für die schwierige Kris-tallisation, liegt in der überdurchschnittlich hohen Anzahl an Cysteinen in der Proteinsequenz. Mit den Aminosäuren Cys171, Cys253 und Cys461 wurden drei Cysteine gefunden, die einem Strukturvergleich nach an der Proteinoberfläche liegen und möglicherweise durch Quervernetzungen mit anderen Proteinmolekülen ein heterogenes Gemisch bilden, das nicht geordnet kristallisieren kann. Durch gezielte Mutationen dieser drei Aminosäuren könnte die Kristallisation zukünftig ermöglicht werden. Für die SG waren bereits Bedingungen bekannt bei denen nicht vermessbare Enzymkristalle (Nadeln) wuchsen. In weit gefächerten Versuchen konnten diese Kristalle jedoch nicht zu 3D-Wachstum angeregt werden. Es wurden mit einem HTS-Screening neue Bedingungen zur Kristallisation gefunden. Anschließend konnten die native Struktur und der Strictosidin/Enzym-Komplex vermessen und aufgeklärt werden. Die SG gehört zur Familie 1 der Glukosidasen (GH-1) und besitzt die in dieser Familie konservierte (beta/alpha)8-Barrel-Faltung. Im Vergleich mit 16 bekannten Glykosidasen der Familie GH-1 wurde die Substratbindung untersucht. Dabei wurde die in der Familie konservierte Zuckerbindung vorgefunden, jedoch große Unterschiede in der Aglykonbindung entdeckt. Es wurden Bedingungen für die Konformationsänderung des Trp388 erkannt. Diese Konformationsänderung dirigiert den Aglykonteil des Substrates auf verschiedene Seiten der Substratbindungstasche und teilt so die Familie GH-1 in zwei Gruppen.
Crystallization of the Arbutin-Synthase and the Strictosidine Glucosidase - two enzymes in the secondary glycoside metabolism of Rauvolfia serpentina In this dissertation the crystallization and structural interpretation of the enzymes Arbutin-Synthase (AS) and Strictosidine Glucosidase (SG) is described. Both enzymes originate from the medicinal plant Rauvolfia serpentina. With about 2500 different conditions the crystallization of AS was tested. Therefore the enzyme was also chemically and molecularbiologically modified. Nevertheless no crystals were obtained. The acquired results were evaluated in comparison to known structures of glycosyltransferases of the same family. Although a wide variety of purification systems was used during the purification of the heterologously expressed AS, a homogeneous solution could never be produced. The most likely cause for the bad separability of AS, and thus the most likely cause for the missing crystallization, is the higher than average number of cysteins in the sequence of AS. Three cysteins (Cys171, Cys253 and Cys461) were identified as positioned on the surface of the protein. Thereby they provide the possibility for crosslink’s between several protein molecules, forming a heterologous solution and inhibiting crystal growth. After point mutations of these three amino acids the crystallization of AS could be possible. In the case of SG there were conditions known that produces needle-shaped enzyme crystals. But these were not suitable for X-ray measurements. In wide variations it was tried to optimize the conditions towards 3D-growth. Only a new High-Throughput-Screening was successful. With the acquired crystals the native structure of SG was solved and after soaking the complex of SG-Glu207Gln/strictosidine was elucidated. SG belongs to family 1 of glycosidases (GH-1) and shows the conserved (beta/alpha)8-barrel fold. The substrate binding of SG was compared with all known structures of that family. Thereby was conserved sugar binding site found, but great differences in the aglycone binding were observed. Conformational changes at Trp388 were studied through point mutations and causes for the changes recorded. By the conformational changes of the large indole part of Trp388 the substrate is directed into two different pockets and thereby is the family divided into two groups of different substrate binding.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-904
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: in Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Appears in collections:JGU-Publikationen

Files in This Item:
File SizeFormat 
1229.pdf6.97 MBAdobe PDFView/Open