Die Rolle des Adhäsions-GPCR VLGR1/ADGRV1 in Mitochondrien-assoziierten ER-Membranen
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Gegenstand der vorliegenden Arbeit war es die Präsenz des USH2C-Proteins VLGR1 in dem subzellulären Kompartiment der Mitochondrien-assoziierten ER-Membranen (MAMs) zu validieren und dessen Rolle bei der Funktion der MAMs aufzuklären. VLGR1 gehört zur Gruppe der Adhäsions-G-Protein gekoppelten Rezeptoren (aGPCRs oder ADGRs) und stellt innerhalb dieser Gruppe den größten Rezeptor dar. Funktionen von VLGR1 stehen in Verbindung zum humanen Usher-Syndrom (USH), der häufigsten Form kombinierter Taub-Blindheit. Zudem gibt es mehr und mehr Hinweise darauf, dass Dysfunktionen von VLGR1 beim Manschen auch zur Ausbildung von Epilepsie führen. Die Grundlage dieser Untersuchungen bilden die Identifikation von potenziellen VLGR1-Interaktionspartnern und dessen Einbindung in Proteinnetzwerke.
In den Publikationen I und II wurden Tandem-Affinitäts-Aufreinigungen (TAPs) mit
verschieden Proteinfragmenten von VLGR1 durchgeführt. Daten aus diesen Analysen wurden auf Basis von Gene Ontology (GO) Termen bioinformatisch gegliedert und ausgewertet. Neben bekannten VLGR1-Proteininteraktionsclustern, welche bereits beschriebene Funktionen des Rezeptors bestätigten, konnten auch Proteine als putative Interaktionspartner identifiziert werden, die auf bislang nicht beschriebene Funktionen von VLGR1 hinweisen. Dazu zählen auch Proteine, die insbesondere in den internen Membranen der Zelle am ER, den Mitochondrien und speziell an Mitochondrien-ER-Kontakten (MAMs) lokalisiert sind.
Publikation III beschreibt die Einführung einer effizienten und robusten Methode zur
Isolierung von primären Astrozyten aus dem Gehirn von Mausmodellen. Diese Arbeit lieferte ein robustes Zellmodel zum Studium von VLGR1 und eine der Grundlagen für unsere Untersuchungen.
In Publikation IV konnte ich die Interaktionen von VLGR1 mit den MAM-Proteinen S1R,
ACSL4 und TOM20 bestätigt. Des Weiteren bestätigte ich mittels immunhistologischen sowie biochemischen Zellfraktionierungen VLGR1 im MAM-Kompartiment.
Elektronenmikroskopische Analysen der MAM-Strukturen zeigten eine Veränderung der
MAM-Komposition in Neuronen der Retina und des Gehirns des Vlgr1-defizienten
Vlgr1/del7TM Mausmodell im Vergleich zu Wild-Type-Mäusen. Abschließend konnte ich
mittels Ca2+-Imaging unter Einsatz von ER- und Mitochondrien-spezifischen Ca2+
-Sensoren zeigen, dass VLGR1 essential für die Aufrechterhaltung der Ca2+
-Homöostase in den MAMs ist. Das Fehlen von VLGR1 führt in Vlgr1-defizienten primären Astrozyten aus dem Gehirn von Vlgr1/delTM-Mäusen im Vergleich zur Wild-Type-Kontrolle zu einem verringerten Ca2+-Ausstrom aus dem ER und nachfolgen auch zu einem geringeren Einstrom von Ca2+ in die Mitochondrien.
Zusammengefasst leisten die erarbeiteten Ergebnisse und die daraus gezogenen Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit einen entscheidenden Beitrag zur Aufschlüsselung der molekularen und zellulären Funktion des Adhäsions-GPCR VLGR1/ADGRV1 und liefern zudem auch wertvolle Hinweise auf die Pathogenese bei VLGR1-Dysfunktionen. Insbesondere die Aufklärung von VLGR1 als MAM-Komponente, kann zum Verständnis der USH und Epilepsie zugrundeliegenden Pathomechanismen beitragen.