Authors:	Krzysko, Jacek
Advisor:	Wolfrum, Uwe
Title:	Die Rolle des Adhäsions-GPCR VLGR1/ADGRV1 in Mitochondrien-assoziierten ER-Membranen
Online publication date:	6-Apr-2023
Year of first publication:	2023
Language:	german
Abstract:	Gegenstand der vorliegenden Arbeit war es die Präsenz des USH2C-Proteins VLGR1 in dem subzellulären Kompartiment der Mitochondrien-assoziierten ER-Membranen (MAMs) zu validieren und dessen Rolle bei der Funktion der MAMs aufzuklären. VLGR1 gehört zur Gruppe der Adhäsions-G-Protein gekoppelten Rezeptoren (aGPCRs oder ADGRs) und stellt innerhalb dieser Gruppe den größten Rezeptor dar. Funktionen von VLGR1 stehen in Verbindung zum humanen Usher-Syndrom (USH), der häufigsten Form kombinierter Taub-Blindheit. Zudem gibt es mehr und mehr Hinweise darauf, dass Dysfunktionen von VLGR1 beim Manschen auch zur Ausbildung von Epilepsie führen. Die Grundlage dieser Untersuchungen bilden die Identifikation von potenziellen VLGR1-Interaktionspartnern und dessen Einbindung in Proteinnetzwerke. In den Publikationen I und II wurden Tandem-Affinitäts-Aufreinigungen (TAPs) mit verschieden Proteinfragmenten von VLGR1 durchgeführt. Daten aus diesen Analysen wurden auf Basis von Gene Ontology (GO) Termen bioinformatisch gegliedert und ausgewertet. Neben bekannten VLGR1-Proteininteraktionsclustern, welche bereits beschriebene Funktionen des Rezeptors bestätigten, konnten auch Proteine als putative Interaktionspartner identifiziert werden, die auf bislang nicht beschriebene Funktionen von VLGR1 hinweisen. Dazu zählen auch Proteine, die insbesondere in den internen Membranen der Zelle am ER, den Mitochondrien und speziell an Mitochondrien-ER-Kontakten (MAMs) lokalisiert sind. Publikation III beschreibt die Einführung einer effizienten und robusten Methode zur Isolierung von primären Astrozyten aus dem Gehirn von Mausmodellen. Diese Arbeit lieferte ein robustes Zellmodel zum Studium von VLGR1 und eine der Grundlagen für unsere Untersuchungen. In Publikation IV konnte ich die Interaktionen von VLGR1 mit den MAM-Proteinen S1R, ACSL4 und TOM20 bestätigt. Des Weiteren bestätigte ich mittels immunhistologischen sowie biochemischen Zellfraktionierungen VLGR1 im MAM-Kompartiment. Elektronenmikroskopische Analysen der MAM-Strukturen zeigten eine Veränderung der MAM-Komposition in Neuronen der Retina und des Gehirns des Vlgr1-defizienten Vlgr1/del7TM Mausmodell im Vergleich zu Wild-Type-Mäusen. Abschließend konnte ich mittels Ca2+-Imaging unter Einsatz von ER- und Mitochondrien-spezifischen Ca2+ -Sensoren zeigen, dass VLGR1 essential für die Aufrechterhaltung der Ca2+ -Homöostase in den MAMs ist. Das Fehlen von VLGR1 führt in Vlgr1-defizienten primären Astrozyten aus dem Gehirn von Vlgr1/delTM-Mäusen im Vergleich zur Wild-Type-Kontrolle zu einem verringerten Ca2+-Ausstrom aus dem ER und nachfolgen auch zu einem geringeren Einstrom von Ca2+ in die Mitochondrien. Zusammengefasst leisten die erarbeiteten Ergebnisse und die daraus gezogenen Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit einen entscheidenden Beitrag zur Aufschlüsselung der molekularen und zellulären Funktion des Adhäsions-GPCR VLGR1/ADGRV1 und liefern zudem auch wertvolle Hinweise auf die Pathogenese bei VLGR1-Dysfunktionen. Insbesondere die Aufklärung von VLGR1 als MAM-Komponente, kann zum Verständnis der USH und Epilepsie zugrundeliegenden Pathomechanismen beitragen. The subject of the present work was to validate the presence of the USH2C protein VLGR1 in the subcellular compartment of mitochondria-associated ER membranes (MAMs) and to elucidate its role in MAM function. VLGR1 belongs to the group of adhesion G-protein coupled (aGPCRs or ADGRs) and represents the largest receptor within this group. Functions of VLGR1 are associated with human Usher syndrome (USH), the most common form of combined deaf-blindness and epilepsy. In addition, there is increasing evidence that dysfunctions of VLGR1 in humans also lead to the development of epilepsy. These studies are based on the identification of potential VLGR1 interaction partners and their involvement in protein networks. In publications I and II, tandem affinity purifications (TAPs) were performed with different protein fragments of VLGR1. Data from these analyses were bioinformatically parsed and analyzed based on Gene Ontology (GO). In addition to known VLGR1 protein interaction clusters, which confirmed previously described functions of the receptor, proteins were also identified as putative interaction partners indicating not described functions of VLGR1. These include proteins localized specifically to the ER, mitochondria, and specifically mitochondria-ER contacts (MAMs). Publication III describes the introduction of an efficient and robust method to isolate primary astrocytes from brain of mouse models. This work provided a robust cell model for studying VLGR1 and one of the bases for our studies. In publication IV, I was able to confirm the interactions of VLGR1 with the MAM proteins S1R, ACSL4, and TOM20. Furthermore, I confirmed VLGR1 as a MAM resident by immunohistochemical as well as biochemical cell fractionation. Electron microscopicanalysis of MAM structures, revealed a change in MAM composition in neurons of the retina and brain of the Vlgr1-deficient Vlgr1/delTM mouse model compared with wild-type mice. In conclusion, I demonstrated by Ca2+ imaging using ER- and mitochondria-specific Ca2+ sensors that VLGR1 is essential for maintaining Ca2+ homeostasis at MAMs. Absence of VLGR1 results in reduced Ca2+ efflux from the ER in Vlgr1-deficient primary astrocytes from the brain of Vlgr1/delTM mice compared with wild-type controls and, subsequently, in reduced Ca2+influx into mitochondria In summary, the elaborated results and the findings derived from the present work make a critical contribution to the unraveling of the molecular and cellular function of the adhesion GPCR VLGR1/ADGRV1 and also provide valuable information to the pathogenesis in VLGR1 dysfunctions . In particular, the elucidation of VLGR1 as a MAM component may contribute to the understanding of the pathomechanism underlying USH and epilepsy.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-8949
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-c038c259-be7f-4a4f-a88f-3f5f6506c2b97
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	Getrennte Zählungen ; Illustrationen, Diagramme
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