Authors:	Bercht, Marc
Title:	Generierung und Prozessierung oxidativer DNA-Schäden
Online publication date:	12-Dec-2006
Year of first publication:	2006
Language:	german
Abstract:	Generierung und Prozessierung oxidativer DNA Schäden --- Ziel dieser Arbeit war es, adaptive Antworten der Zellen auf einen DNA Schädigung zu untersuchen. Hierzu wurden Experimente zur Reparatur oxidierter Basen (Substrate der Basen Exzisions Reparatur (BER)) oder von Pyrimidindimeren (Substrate der Nukleotid Exzisions Reparatur (NER)) nach einer Vorbehandlung mit DNA-schädigender Agenzien durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass sowohl eine Vorbehandlung mit einer alkylierenden als auch mit einer oxidierenden Substanz zu einer adaptiven Erhöhung des zellulären Glutathionspiegels führte, die 16 h nach der Schädigung ihr Maximum erreichte. Jedoch waren die 8-oxoG Glykosylaseaktivitäten über einen Zeitraum von 18 h konstant. Diese Effekte waren unabhängig davon, ob Maus Embryofibroblasten, primäre oder p53 profiziente menschliche Zellen verwendet wurden. Die BER war ebenfalls in keiner der verschiedenen Zelllinien signifikant verbessert. Die adaptive Antwort bezüglich der Glutathionspiegel war also nicht mit einer entsprechenden Veränderung bei der DNA-Reparatur verbunden. Folglich ist die Reparatur von oxidativen DNA-Schäden durch eine vorausgehende Schädigung nicht induzierbar. Der zweite Teil der Untersuchungen zu der Reparatur beschäftigte sich mit der NER. Hierzu wurde die Reaktivierung eines mit UVB-Strahlung geschädigten Plasmids untersucht. Als Wirtszellen fungierten primäre menschliche Fibroblasten und Keratinozyten, die entweder mit UVB vorbehandelt oder ungeschädigt waren. Auch für die NER konnte keine signifikante Beschleunigung der Reparatur von Pyrimidindimeren durch eine Vorbehandlung festgestellt werden. Die Reaktivierung erfolgte ferner unabhängig vom p53-Status der Zellen, wie Versuche mit p53-siRNA zeigten. Neben der Prozessierung war die Generierung oxidativer DNA Schäden Gegenstand der Arbeit. Die verwendete Substanz Tirapazamin (TPZ) ist ein für hypoxische Zellen selektives, neues Zytostatikum und befindet sich momentan in Phase 2/3 der klinischen Prüfung. Ziel war es die von TPZ verursachten DNA Modifikationen zu charakterisieren, sowie die Toxizität und Genotoxizität zu untersuchen. Da es Hinweise auf eine Aktivierung von TPZ über eine Oxidoreduktase (OR) gab, wurden die Experimente in Wildtyp und hOR überexprimierenden Zellen durchgeführt. Die Quantifizierung der verursachten DNA-Modifikationen zeigte, dass der von TPZ verursachte Schaden in Zellen mit hOR erhöht war. Das erhaltene Schadensprofil der durch TPZ verursachten DNA-Modifikationen war dem Schadensprofil von durch Gamma-Strahlung intrazellulär verursachten Hydroxylradikalen sehr ähnlich. Da es nach der Aktivierung von TPZ durch eine OR zu einer Abspaltung von Hydroxylradikalen kommt, bestätigte dies den vermuteten Mechanismus. Weitere Untersuchungen mit t-Butanol, einem Hydroxylradikal Fänger, ergaben eine verminderte DNA-Schädigung, was ebenfalls für eine DNA-Schädigung durch Hydroxylradikale spricht. Untersuchungen zur Mutagenität zeigten das die Mutationsrate in Zellen mit hOR um das 4 fache erhöht ist. Erstaunlich war jedoch, dass der im gleichen Ausmaß von Gamma-Strahlung verursachte DNA-Schaden für die beobachtete Toxizität dieser verantwortlich war, während bei TPZ unter den gleichen Bedingungen keine Toxizität vorlag. Erklärt werden könnte die erhöhte Toxizität und Mutagenität durch so genannte geclusterte DNA-Schäden, die von Gamma-Strahlen, nicht jedoch von TPZ gebildet werden. Nach einer verlängerten Inkubation wurde sowohl für die Toxizität als auch für die Genotoxizität erneut ein verstärkender Effekt durch die OR bestätigt. Überraschend war weiterhin die von der OR unabhängige Generierung von Doppelstrangbrüchen, für die demnach ein grundsätzlich anderer Mechanismus, wie zum Beispiel eine direkte Interaktion mit der Topoisomerase II, angenommen werden muss. Generation and processing of oxidative DNA damage --- The purpose of this work was to study adaptive effects of cells under the influence of DNA damaging substances. To analyse these effects, experiments were performed which examine the repair of oxidative DNA damage (which is mostly repaired by the base excision repair (BER)) or pyrimidine dimers (which are substrate of the nucleotide excision repair (NER)), subsequent to a pre-treatment with several DNA-damaging substances. The results clearly indicate that a pre-treatment either with an alkylating or an oxidizing substance both lead to an adaptive increase of the cellular glutathione levels, showing a maximum 16 h after the treatment. By contrast, both in mouse fibroblasts and in primary or p53 proficient human cells, the 8-oxoG cleavage activity was not affected within 18 h after the treatment. The BER was also not improved within this time span. Therefore it is our conclusion that the adaptive responses of the glutathione levels have no effect on the DNA repair, nor do they induce a higher level of protection. In the second part of the study the NER was examined using a UVB damaged plasmid in a reactivation assay, with UVB damaged and undamaged primary human fibroblasts or keratinocytes. The results of the NER indicate that there is no enhanced repair of UVB induced DNA damage in any of the pre-treated cell lines; furthermore it is independent of the cellular p53 status. The latter was shown using a p53 knockdown with siRNA. The study further compares processing versus generation of oxidative DNA damage. Tirapazamine (TPZ), the substance used in these experiments, is a selective hypoxic cell killing drug which is currently in phase two and three of the clinical trials. The purpose of the experiments was to characterise and analyse the induced DNA damage, toxicity and genotoxicity of TPZ. Due to indications that TPZ is activated by and oxidoreductase (OR), the experiments were performed using both wildtype and hOR overexpressing cells. The quantification of the induced DNA damage indicates that in hOR cells the TPZ induced damage is elevated. The DNA damage profile of TPZ is similar to the DNA damage profile caused by gamma rays via intracellular generated hydroxyl radicals. This gives rise to the suspected mechanism of an activation of TPZ via an OR which would lead to hydroxyl radicals as well. Further experiments with t-Butanol (a hydroxyl radical scavenger) confirmed this assumption. The experiments of the mutagenicity showed a four times elevated mutagenicity in hOR cells compared to wildtype cells. An unexpected result was that, while the DNA damage induced by gamma rays was responsible for the toxicity, it seems that the DNA damage via TPZ has no apparent effect on the toxicity. An explanation might be the fact that, contrary to TPZ, gamma rays induce clustered DNA lesions. After a prolonged incubation, both the toxicity and genotoxicity was again elevated in the cells with the hOR. Another unexpected observation for TPZ lies in the amount of generated DNA double strand breaks (DSB) which appear to be hOR independent. Therefore we conclude that a fundamentally different mechanism, such as an interaction of the topoisomerse II, must be considered for DSB.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-893
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-12175
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
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