Authors:	da Costa Marques, Richard
Title:	Proteomic studies on intracellular nanocarrier trafficking and regenerative bone substitute materials
Online publication date:	27-Mar-2023
Year of first publication:	2023
Language:	english
Abstract:	The design and medical performance of nano- and biomaterials remain impacted by the adsorption of biomolecules, specifically the adsorption of proteins. Protein adsorption is inevitably initiated upon contact with biological fluids or tissues, leading to a change in the surface properties of the materials. These changed surface properties evoke undesired biological effects, posing a major drawback for indented medical purposes. To overcome this drawback, or even exploit protein adsorption, it is necessary to analyze the composition of adsorbed proteins and study the interactions with cells, tissues, and organisms. This thesis addresses the challenges of protein adsorption on nanoparticles (NPs) in intracellular environments and on calcium phosphate (CaP) biomaterial surfaces for bone substitution. The layers of adsorbed proteins on NPs are termed protein corona. The formation of the protein corona is influenced by the protein milieu and the physicochemical properties of the NPs. The protein corona has been studied with various biological fluids and NP systems, but the comparability of these studies remains challenging. To address the lacking comparability, the study presented in chapter A of this thesis analyzed the protein corona formation under different plasma protein concentrations, temperatures, and NP surface modifications. Here, we observed different outcomes in protein adsorption and cell uptake when varying surface charge and surfactant on polystyrene NPs at consistent concentration and temperature. Notably, decreasing protein concentration and temperature during the protein corona formation resulted in increased cellular uptake for all studied NP types. The results highlight the necessity to thoughtfully select experimental conditions for protein corona studies. Despite numerous studies of the protein corona in extracellular environments, the cellular processing of NPs and the formation of the intracellular protein corona continue to be poorly studied. Considering that the protein corona influences the cellular uptake and intracellular NP cargo release, it is crucial to characterize the intracellular protein corona. The first study of chapter B investigated the intracellular separation and fate of a preabsorbed protein corona on polystyrene NPs. By utilizing correlative light and electron microscopy and flow cytometry, the endosomal separation of corona proteins and NPs into morphologically distinct endosomal compartments was demonstrated. Eventually, the NPs were exocytosed, and the protein corona was processed for lysosomal degradation. The second study of chapter B revealed the intracellular trafficking of two biocompatible NP types by implementing proteomic analysis. We demonstrated a gradual evolution of the protein corona for hydroxyethyl starch NPs with a slower uptake while demonstrating a stable protein corona for human serum albumin nanocapsules with an accelerated uptake. Additionally, by unraveling the intracellular protein corona, we reconstructed molecular details during the intracellular trafficking andomplemented the results by flow cytometry and microscopy. For the third study of chapter B, the analysis of the intracellular protein corona was applied to investigate the endocytosis of gold NPs for imaging applications in stromal cells. The exocytosis of gold NPs was dependent on the performed loading protocol. Especially higher loading with gold NPs resulted in lower exocytosis when compared to a lower loading. Here, the analysis of the intracellular protein corona revealed that a higher loading led to an enrichment of intracellular proteins, decreasing exocytosis. Overall, the studies in this chapter demonstrated that detailed characterizations of the intracellular protein corona will improve NP application in drug delivery and imaging. Chapter C focuses on protein adsorption on bulk biomaterial with nanostructured surfaces. To provide regenerative properties to synthetic biomaterials for bone substitution, the biomaterials are combined with growth factor-rich hemoderivatives. However, the composition of the adsorbed proteins is rarely investigated. The study in chapter C investigated the protein adsorption from hemoderivative protein sources on CaP bone substitutes regarding their regenerative potential for angiogenesis. Using proteomic studies, we identified abundantly adsorbed non-angiogenic and anti-angiogenic proteins. Furthermore, we measured the depletion of pro-angiogenic growth factors. The pro-angiogenic effects were analyzed by tube- formation assays with endothelial cells. Here, we observed pro-angiogenic effects when the CaPs were kept in the hemoderivative protein source but not after washing with PBS. These results emphasize the importance of analyzing protein adsorption to improve the regenerative, e. g. pro-angiogenic capabilities of biomaterials. In conclusion, the presented studies emphasize the benefits of protein adsorption analysis for the development of nano- and biomaterials with medical applications. The future design of these materials will tremendously profit from studying surface-adsorbed proteins and exploiting this knowledge to modulate desired biological effects. Das Design und die medizinische Wirkung von Nano- und Biomaterialien werden durch die Adsorption von Biomolekülen, insbesondere von Proteinen, beeinflusst. Die Adsorption von Proteinen wird unweigerlich durch den Kontakt mit biologischen Flüssigkeiten oder Geweben ausgelöst, was zur Veränderung der Oberflächeneigenschaften der Materialien führt. Diese veränderten Oberflächeneigenschaften führen wiederum zu unerwünschten biologischen Effekten, die einen großen Nachteil für die medizinische Anwendung darstellen. Um diesen Nachteil zu überwinden oder die Proteinadsorption sogar gezielt auszunutzen, ist es notwendig, die Zusammensetzung der adsorbierten Proteine zu analysieren und deren Wechselwirkungen mit Zellen, Geweben und Organismen zu untersuchen. Die vorliegende Dissertation befasst sich mit den Untersuchungen der Proteinadsorption an Nanopartikeln (NPs) in intrazellulären Umgebungen und an Kalziumphosphat-basierten (CaP) Biomaterialoberflächen für den Knochenersatz. Proteine adsorbieren schichtenartig an NPs, was als Proteinkorona bezeichnet wird. Die Bildung der Proteinkorona wird durch das Proteinmilieu und die physikochemischen Eigen- schaften der NPs beeinflusst. Bisher wurde die Proteinkorona in verschiedenen biologischen Flüssigkeiten und mit unterschiedlichen NP-Systemen untersucht, jedoch lassen sich die Studien nur schwer vergleichen. Um diese mangelnde Vergleichbarkeit zu adressieren, wurde in der Studie des Kapitels A dieser Arbeit die Bildung der Proteinkorona bei unterschiedlichen Proteinkonzentrationen, Temperaturen und NP-Oberflächenmodifikationen untersucht. Durch Variation von Oberflächenladungen und Tensiden bei Polystyrol-NPs wurden unterschiedliche Ergebnisse in Proteinadsorption und Zellaufnahme bei gleichbleibender Konzentration und Temperatur beobachtet. Insbesondere führte eine Verringerung der Proteinkonzentration und Temperatur während der Bildung der Proteinkorona bei allen untersuchten NP-Typen zu einer erhöhten zellulären Aufnahme. Die Ergebnisse unterstreichen die Notwendigkeit, die experimentellen Bedingungen für Proteinkorona-Studien sorgfältig auszuwählen. Trotz zahlreicher Studien zur Proteinkorona in extrazellulären Umgebungen bleiben die zelluläre Verarbeitung von NPs und die Bildung der intrazellulären Proteinkorona nur unzureichend untersucht. Da die Proteinkorona jedoch die zelluläre Aufnahme von NPs und die intrazelluläre Wirkstofffreisetzung beeinflusst, ist es von entscheidender Bedeutung, die intrazelluläre Proteinkorona zu charakterisieren. Die erste Studie in Kapitel B untersuchte die intrazelluläre Trennung und den Verbleib einer voradsorbierten Proteinkorona auf Polystyrol- NPs. Mittels korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie und Durchflusszytometrie wurde die endosomale Trennung von Korona-Proteinen und NPs in morphologisch unterschiedliche endosomale Kompartimente nachgewiesen. Schließlich wurden die NP exozytiert und die Proteinkorona für in den lysosomalen Abbauweg geschleust. In der zweiten Studie des Kapitels B wurde der intrazelluläre Transport von zwei biokompatiblen NP-Systemen durch die Implementierung von Proteomanalysen untersucht. Die vergleichbar langsame zelluläre Aufnahme von Hydroxyethylstärke-NPs korrelierte mit einer zeitlichen Veränderung der intrazellulären Proteinkorona, während eine beschleunigte Aufnahme der Humanalbumin- Nanokapseln mit einer stabilen Proteinkorona korrelierten. Durch die Analyse der intrazellulären Proteinkorona wurden zusätzlich molekulare Details der intrazellulären Verarbeitung rekonstruieren, was die Ergebnisse durch Durchflusszytometrie und Mikroskopie ergänzte. In der dritten Studie des Kapitels B wurde die intrazelluläre Proteinkorona analysiert, um die Endozytose von Gold-NPs für bildgebende Anwendungen in Stromazellen zu untersuchen. Die untersuchte Exozytose der Gold-NPs war abhängig vom durchgeführten Beladungsprotokoll. Insbesondere eine höhere Beladung mit Gold-NPs führte zu einer geringeren Exozytose, im Vergleich zu einer geringeren Beladung. Hier zeigte die Analyse der intrazellulären Proteinkorona, dass eine höhere Beladung zu einer Anreicherung von intrazellulären Proteinen führte und dies vermutlich die Exozytose verringerte. Insgesamt haben die Studien in diesem Kapitel gezeigt, dass eine detaillierte Charakterisierung der intrazellulären Proteinkorona die Anwendung von NP in der Wirkstofffreisetzung und in bildgebenden Verfahren verbessern. Kapitel C befasst sich mit der Proteinadsorption an Oberflächen von Biomaterialien mit nanostrukturierten Oberflächen. Um synthetische Biomaterialien für den Knochenersatz regenerative Eigenschaften zu verleihen, werden die Biomaterialien mit Wachstumsfaktor- reichen Blutprodukten kombiniert. Die Zusammensetzung der adsorbierten Proteine wird jedoch nur selten untersucht. Die Studie in Kapitel C untersuchte die Proteinadsorption aus Blutprodukten an CaP-Knochenersatzmaterialien im Hinblick auf ihr regeneratives Potenzial für die Angiogenese. Durch proteomische Studien wurde eine Anreicherung von nicht- angiogenen und anti-angiogenen Proteinen nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die Abreicherung von pro-angiogenen Wachstumsfaktoren gemessen. Die pro-angiogenen Wirkungen wurden mittels Tube-Formation Assays mit Endothelzellen analysiert. Hier wurden pro-angiogene Effekte beobachtet, solange die CaPs in den Blutprodukten verblieben, jedoch nicht nach dem Waschen mit PBS. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung von Untersuchungen der Proteinadsorption zur Verbesserung der regenerativen oder pro- angiogenen Wirkung von Biomaterialien. Zusammengefasst unterstreichen die dargestellten Studien den Nutzen der Analyse von Proteinadsorption auf Nano- und Biomaterialien für die medizinische Anwendung. Das Design dieser Materialien wird von Proteinadsorptionsanalysen zukünftig profitieren. Die hierbei gesammelte Expertise kann zudem zur Modulation von gewünschten biologischen Wirkungen genutzt werden.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-8859
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-a997cae8-b9cf-4a8b-8458-68f6414901b45
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	CC BY
Information on rights of use:	https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Extent:	XIII, 211 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen