Authors:	Liu, Fobang
Title:	Chemical modification of proteins by air pollutants and metaproteomic analysis of atmospheric aerosol samples by HPLC‐MS analyses
Online publication date:	27-Jun-2017
Year of first publication:	2017
Language:	english
Abstract:	Proteins are a major component of bioaerosols and can account for several percent of air particulate matter. They may influence the climate and public health depending on their properties, e.g., hygroscopicity, molecular composition and structure. The interaction with anthropogenic air pollutants can modify their physical, chemical and biological properties, thus altering their climate and health effects. In particular, chemical modifications of proteins (e.g., nitration and cross‐linking) induced by air pollutants, have been linked to an enhanced potency of allergenic proteins. The mechanisms and kinetics of the underlying chemical processes, however, are not yet well understood. In this thesis, the reaction products, kinetics and mechanisms of atmospheric protein chemistry were studied, and the proteome of atmospheric aerosol samples was characterized using high performance liquid chromatography coupled with diode array detection and fluorescence detection (HPLC‐DAD and HPLC‐DAD‐FLD), and HPLC coupled to mass spectrometry (HPLC‐MS/MS). The focus areas of this thesis can be summarized as follows: 1.Development of a method to characterize proteins from atmospheric aerosol samples using a mass spectrometry‐based metaproteomic approach. Extraction solvents were optimized to overcome the interaction between proteins and glass fiber filters and achieve high protein recoveries. Size exclusion chromatography (SEC) was applied to remove matrix components. Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS‐PAGE) was applied for protein fractionation according to molecular size, followed by in‐gel digestion. The digested peptides were analyzed using a hybrid Quadrupole‐Orbitrap MS and database search functions. The developed method has been successfully applied for protein identification from filters samples collected in central Europe (Mainz, Germany). The presented method provides a tool for further studies of spatiotemporal variability of bioparticles and allergens in atmospheric aerosol samples. 2.Elucidation of the mechanisms and kinetics of protein nitration and oligomerization induced by ozone (O3) and nitrogen dioxide (NO2). Proteins were exposed to O3, and O3/NO2 mixtures in coated‐wall flow‐tube and bulk-solution experiments, using bovine serum albumin (BSA) as a model protein. An SEC‐HPLC‐DAD method was developed that enables the simultaneous detection of mono‐, di‐, tri‐, and higher protein oligomers as well as their individual nitration degrees (NDs). In the reaction of BSA with O3, the formation of protein dimers, trimers and higher oligomers was observed. The SDS‐PAGE and fluorescence analysis results revealed that the protein cross‐linking can be attributed to the formation of intermolecular dityrosine species. For the reactions of BSA with O3 and NO2, more tyrosine residues were found to react via the nitration pathways than via the oligomerization pathways. Depending on reaction conditions, oligomer mass fractions and NDs were in the range of 2.5‐25% and 0.5‐7%, respectively. The extent of protein nitration and oligomerization strongly depended on the phase state of proteins (i.e., amorphous solid, semi‐solid, liquid) and hence the diffusivity of oxidants and protein molecules, which change with relative humidity. The experimental results can be explained and described by a kinetic multi‐layer model of surface and bulk chemistry. The rates of both processes were sensitive to the increase of O3 concentrations but rather insensitive to the change in ambient NO2 concentrations. 3.Identification and quantification of free amino acids released upon oxidation of peptides and proteins by hydroxyl radicals. The oxidation products of proteins and peptides generated by hydroxyl radicals from Fenton reactions were analyzed using HPLC‐MS/MS and HPLC‐DAD‐FLD. Free amino acids were identified as products by HPLC‐MS/MS analysis. A site‐selective formation of free amino acids was also observed, which may be due to a reaction pathway involving nitrogen‐centered radicals. For protein oxidation reactions, the molar yields of glycine (Gly, ~32‐55% for BSA, ~10‐21% for ovalbumin (OVA)) were substantially higher than for the other identified amino acids (i.e., alanine, aspartic acid, and asparagine; ~5‐12% for BSA, ~4‐6% for OVA). Upon oxidation of tripeptides with Gly in C‐terminal, mid‐chain, or N‐terminal positions, Gly was preferentially released when it was located at the C‐terminal site. The methods developed and reaction products, kinetics, and mechanisms studied in this thesis provide a basis for further investigations of atmospheric protein chemistry influenced by air pollutants. They shall help to understand the relations between air pollutant‐modified aeroallergens and their enhanced allergenicity. Proteine sind eine Hauptkomponente biologischer Aerosolpartikeln können mehrere Prozent der gesamten Partikelmasse in der Luft ausmachen. Diese Proteine können abhängig von ihren Eigenschaften, wie Hygroskopizität, molekularer Zusammensetzung und Struktur, das Klima der Erde beeinflussen und sich auf die Gesundheit der Lebewesen auswirken. Durch die Wechselwirkungen mit anthropogenen Luftschadstoffen können die physikalischen, chemischen und biologischen Eigenschaften der Proteine modifiziert werden und demnach Auswirkungen auf das Klima und die Gesundheit haben. Insbesondere die von Luftschadstoffen hervorgerufene chemische Modifikationen von Proteinen (z.B. Nitrierung und Quervernetzung) konnten bereits mit einer verstärkten Allergenwirkung der entsprechenden Proteine in Zusammenhang gebracht werden. Allerdings sind weder die Mechanismen noch die Kinetik der zugrundeliegenden chemischen Prozesse ausreichend verstanden. In der vorliegenden Doktorarbeit wurden basierend auf der Anwendung von Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gekoppelt mit Diodenarray-Detektion und Fluoreszenzdetektion (HPLC-DAD und HPLC-FLD), sowie HPLC gekoppelt an Massenspektrometrie (HPLC-MS/MS) die Reaktionsprodukte, die Kinetik und die Mechanismen der Interaktion mit Luftschadstoffen untersucht und Proteine aus atmosphärischen Aerosolproben charakterisiert. Die Hauptpunkte dieser Arbeit können wie folgt zusammengefasst werden: 1.Entwicklung einer Methode zur Charakterisierung von Proteinen aus atmosphärischen Aerosolproben unter Anwendung eines metaproteomischen Ansatzes basierend auf Massenspektrometrie. Die Extraktionsmethode wurde optimiert, um die Interaktion zwischen Proteinen und Glasfaserfiltern zu überwinden und somit eine hohe Proteinrückgewinnung zu erreichen. Zur Entfernung von Matrixkomponenten wurde die Größenausschlusschromatographie (SEC) verwendet. Zur Auftrennung der Proteine anhand ihrer molekularen Größe, wurde Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgel-elektrophorese (SDS-PAGE) angewendet. Anschließend wurden die Proteine im Gel verdaut und die entstandenen Peptide mit Hilfe eines hybriden Quadrupol-Orbitrap-Massenspektrometers und Datenbanksuchfunktionen analysiert. Die entwickelte Methode konnte erfolgreich auf die Identifikation von Proteinen aus in Mitteleuropa (Mainz, Deutschland) gesammelten Filterproben angewendet werden. Zudem bietet sie ein Werkzeug für weitere Studien über die räumliche und zeitliche Variabilität von Biopartikeln und Allergenen in atmosphärischen Aerosolproben. 2.Aufklärung des Mechanismus und der Kinetik der Nitrierung und Oligomerisierung von Tyrosinresten in Proteinen durch Ozon (O3) und Stickstoffdioxid (NO2). Hierfür wurden Proteine entweder auf die Wand eines Durchflussrohres aufgetragen oder in Lösung gebracht und O3 oder einer Mischung aus O3 und NO2 ausgesetzt. Rinderserumalbumin (BSA) diente hierbei als Modellprotein. Des Weiteren wurde eine effiziente Methode mit SEC-HPLC-DAD entwickelt, welche die simultane Bestimmung von einfachen, zweifachen, dreifachen und höheren Proteinoligomeren sowie ihrer individuellen Nitrierungsgrade (NDs) ermöglicht. Für die Reaktion von BSA mit O3 wurde die Bildung von Proteindimeren, -trimeren und höheren Oligomeren beobachtet. Die Ergebnisse von SDS-PAGE und Fluoreszenzanalyse zeigen, dass die Proteinquervernetzung auf die Bildung von intramolekularen Dityrosinen zurückzuführen ist. Für die Reaktion von BSA mit O3 und NO2 wurden mehr Tyrosinreste gefunden, die dem Nitrierungsweg folgen, als die den Weg der Oligomerisierung gehen. Abhängig von den Reaktionsbedingungen lag der Anteil an Oligomeren im Bereich von 2.5-25% und die NDs bei 0.5-7%. Das Ausmaß der Nitrierung und Oligomerisierung von Proteinen ist stark abhängig von ihrem Aggregatzustand (glasartig, halbfest, flüssig) und damit vom Diffusionsvermögen der Oxidationsmittel und Proteinmoleküle, das sich mit der relativen Luftfeuchtigkeit verändert. Die experimentellen Ergebnisse können unter Zuhilfenahme eines kinetischen Mehrschichtenmodells der Oberflächen- und Kernmaterialchemie beschrieben und erklärt werden. Die Reaktionsraten der beiden Prozesse reagierten feinfühlig auf einen Anstieg der O3-Konzentration, waren aber nahezu unempfindlich gegenüber Veränderungen in der umgebenden NO2-Konzentration. 3.Freisetzung von freien Aminosäuren als Folge der Oxidation von Peptiden und Proteinen durch Hydroxylradikale. Die Oxidationsprodukte von Proteinen und Peptiden, die durch Hydroxylradikale aus der Fenton-Reaktion entstanden sind, wurden mittels HPLC-MS/MS und HPLC-DAD-FLD analysiert. Freie Aminosäuren wurden durch HPLC-MS/MS-Analyse als Produkte identifiziert. Darüber hinaus wurde eine seitenselektive Bildung von freien Aminosäuren beobachtet, die durch einen Reaktionsweg erklärt werden könnte, der Stickstoff-zentrierte Radikale beinhaltet. Die molaren Ausbeuten für Oxidationsreaktionen waren wesentlich größer für Glycin (Gly, ~32‐55 % für BSA, ~10‐21 % für Ovalbumin (OVA)) als für andere identifizierte Aminosäuren (z.B. Alanin, Asparaginsäure, und Asparagin; ~5‐12 % für BSA, ~4‐6 % für OVA). Bei der Oxidation von Tripeptiden mit Gly in C-terminaler, zentraler oder N-terminaler Position wurde Gly bevorzugt freigesetzt, wenn es sich zuvor am C-terminalen Ende befand. Die in dieser Arbeit entwickelten Methoden, sowie die untersuchten Reaktionsprodukte, Mechanismen und Kinetik bieten eine Grundlage für weitere Untersuchungen der atmosphärischen Proteinchemie mit Luftschadstoffen. Sie sollen helfen, die Beziehungen zwischen durch Luftschadstoffe modifizierten Aeroallergenen und ihrer verstärkten Allergenität besser zu verstehen.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-871
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000013834
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	xv, 119 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen