Please use this identifier to cite or link to this item: http://doi.org/10.25358/openscience-867
Authors: Heylmann, Daniel
Title: Sensitivität humaner Immunzellen gegenüber ionisierender Strahlung und anderen genotoxischen Noxen
Online publication date: 20-Jun-2017
Language: german
Abstract: Der Mensch ist stets radioaktiver Strahlung ausgesetzt: täglich durch die natürliche Hintergrundstrahlung, bei Reisen mit dem Flugzeug, in radioaktiv verseuchten Gebieten nach nuklearen Unfällen sowie in medizinischer Diagnostik und Therapie. Die Zellen im menschlichen Körper reagieren nicht in gleicher Weise auf ionisierende Strahlung (IR). Insbesondere Blutzellen sind sehr strahlensensitiv. Dies führt während der Strahlentherapie zur Immunsuppression. Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, die Strahlensensitivität der verschiedenen Blutzellpopulationen vergleichend zu untersuchen. Es wurde gezeigt, dass lymphoide Blutzellen wie T-, B- und NK-Zellen sowie CD34-positive Vorläuferzellen signifikant strahlensensitiver sind als Zellen der myeloiden Reihe wie Monozyten, Makrophagen und Dendritische Zellen. DNA-Doppelstrangbrüche (DSB), die Hauptursache der Toxizität von ionisierender Strahlung, wurden in den untersuchten Blutzellen jedoch effizient repariert. Dies äußerte sich in der zeitlichen Abnahme von H2AX, ein Marker für DSB. Eine Ausnahme bildeten Granulozyten, die nach γ-Strahlung keine H2AX-Foci ausbildeten und keinen strahleninduzierten Zelltod untergingen. T-Zellen von Patienten, die einer Ganzkörperbestrahlung ausgesetzt waren, zeigten signifikant mehr persistierende H2AX-Foci als Monozyten. Im weiteren Verlauf dieser Arbeit wurde eine Methode entwickelt, um DNA-Schäden in Zellen aus nur einem aus der Fingerkuppe mikro-invasiv entnommenen Tropfen Blut zu analysieren. Diese Bluttropfenmethode (blood drop method, BDM) ermöglicht schnelle Analysen von DNA-Schäden in Ko-Färbung mit Oberflächenmarkern von T-Zellen und Monozyten, individuelle Bestimmungen von DNA-Reparaturkinetiken, ein Anfärben weiterer diagnostischer Proteinmarker sowie eine Adaption auf Mausexperimente. Die BDM stellt einen wichtigen Schritt dar, um epidemiologische Feldstudien, bio-dosimetrische Bestimmungen und die Überwachung von Patienten in der personalisierten Krebstherapie hinsichtlich Analysen von DNA-Schäden in Blutzellen einfach und effizient durchführen zu können. Weiterhin wurde in der vorliegenden Arbeit die Strahlensensitivität von unstimulierten und CD3-/CD28-stimulierten T-Zellen (Lymphozyten) verglichen. Eine Aktivierung von CD3- und CD28-Rezeptoren, wie sie bei Immunreaktionen und in der Immuntherapie auftritt, führte in den Zellen zu einer Strahlenresistenz. Es wurde aber auch eine erhöhte Capaseaktivität, PARP-1-Spaltung und eine Induktion von reaktiven Sauerstoffspezies beobachtet. Unstimulierte Lymphozyten starben nach Bestrahlung einen Caspase-unabhängigen Zelltod. In der Reparatur strahleninduzierter DNA-Schäden sowie in der Induktion und Phosphorylierung von p53 konnten keine Unterschiede zwischen unstimulierten und stimulierten Lymphozyten festgestellt werden. Die DNA-Schadensantwort (DNA damage response, DDR) ist jedoch erheblich in der Einleitung des Zelltodes in Lymphozyten nach Bestrahlung beteiligt. So zeigte sich durch eine Hemmung von Faktoren der DDR wie des MRN-Komplexes, ATM, CHK1 und CHK2 ein Schutz von Lymphozyten gegenüber IR. Die strahlenresistenteren stimulierten Lymphozyten zeigten nach IR eine geringere Aktivierung von ATM als auch eine transkriptionelle Herabregulation von ATM im Vergleich zu ihrem unstimulierten Gegenpart. Inhibitoren von ATR, PARP-1, p53, RIPK1, Survivin und MTH1 zeigten keinen Einfluss auf den IR-induzierten Zelltod in Lymphozyten. Eine Hemmung des Enzyms MTH1 war zudem toxisch in stimulierten Lymphozyten. Im Gegensatz zur IR zeigten stimulierte Lymphozyten im Vergleich zu den unstimulierten Zellen eine hohe Sensitivität gegenüber dem bakteriellen Toxin und Radiomimetikum CDT sowie dem methylierenden Chemotherapeutikum Temozolomid. Unstimulierte Lymphozyten hingegen waren besonders sensitiv gegenüber dem DNA-Crosslinker und Chemotherapeutikum Mafosfamid. Geringe Dosen Mafosfamid zeigten eine selektive Toxizität gegenüber immunhemmenden regulatorischen T-Zellen im Vergleich zu zytotoxischen T-Zellen und T-Helferzellen. Die hier dargestellten Untersuchungen zur DNA-Reparatur und Toxizität von Blutzellen nach gentoxischen Noxen dienen u.a. zur Optimierung immuntherapeutischer Strategien insbesondere in Kombination mit Strahlentherapie, konventioneller Chemotherapie und pharmakologischer Inhibitoren.
Humans are exposed to ionizing radiation (IR) in various settings: daily through natural background radiation, in radioactively contaminated areas after nuclear accidents or in therapeutic interventions. Human cells do not respond equally to IR. Especially blood cells are highly radiosensitive, which results in immunosuppression during radiotherapy. In this work, the sensitivity of different blood cell populations towards IR was studied in a comparative manner. It was shown that lymphoid cells like T cells, B cells, NK cells as well as CD34+ progenitor cells are significantly more radiosensitive as blood cells from the myeloid lineage such as monocytes, macrophages and dendritic cells. DNA double-strand breaks, the main toxic lesion of IR, were repaired efficiently in all analyzed blood cells. This was visualized by a decrease of IR-induced H2AX foci by time. Granulocytes showed no induction of H2AX foci as well as no IR-induced cell death. Interestinlgy, T cells in patients receiving whole-body irradiation showed more persisting H2AX foci as monocytes. Furthermore, we established a method to analyze DNA damage in cells obtained micro-invasively from only one drop of blood from the fingertip. The blood drop method (BDM) allows a simple and fast analysis of DNA damage with co-staining of surface markers from T cells or monocytes, individual screening of DNA repair kinetics and is also applicable for staining of other DNA damage response (DDR) markers as well as for mouse experiments. The BDM represents an important step towards epidemiological field studies, biodosimetric analysis and monitoring of patients in personalized anticancer therapy. On top of that, we compared the radiosensitivity of unstimulated and CD3-/CD28-stimulated T lymphocytes. Activation of these receptors, as it happens in immune responses or following immunotherapy, resulted in radioprotection, but also induced reactive oxygen species, caspase activation and PARP-1 fragmentation. Unstimulated lymphocytes underwent a caspase-independent, AnnexinV-positive cell death. Both, unstimulated and stimulated lymphocytes, repaired IR-induced DNA damage efficiently and showed no differences in induction and phosphorylation of p53. The DNA damage response is considerably involved in triggering cell death in lymphocytes. Thus, inhibition of DDR factors as the MRN complex, ATM, CHK1 and CHK2 conferred protection towards IR in unstimulated lymphocytes. Radioresistant stimulated lymphocytes showed less activation of ATM after IR and transcriptional downregulation of ATM compared to their unstimulated counterpart. Radioprotection of lymphocytes was not obvious after inhibition of ATR, PARP-1, p53, RIPK1, Survivin and MTH1. Moreover, inhibition of MTH1 was toxic in stimulated but not unstimulated cells. In contrast to IR, stimulated lymphocytes showed increased toxicity towards the bacterial toxin CDT, a radiomimetic agent with DNase I-like endonuclease activity, as well as to the methylating anticancer drug temozolomide. However, unstimulated lymphocytes were highly sensitive towards the DNA-crosslinker and chemotherapeutic agent mafosfamide. Especially low doses of mafosfamide showed selective toxicity to immune inhibitory and tumor-protective regulatory T cells compared to cytotoxic T cells and T helper cells. The findings herein are important for optimizing passive and active immunotherapeutic strategies especially in combination with radiotherapy, conventional chemotherapy and pharmacologcical inhibitors and for evaluating immunodeficiency and the implication for the immune response.
DDC: 610 Medizin
610 Medical sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 04 Medizin
Place: Mainz
ROR: https://ror.org/023b0x485
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-867
URN: urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000013730
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: In Copyright
Information on rights of use: https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent: XVI, 198 Seiten
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