Authors:	Janke, Rebekka Susanne
Title:	Dynamics and functionality of a multipartite defensive symbiosis in immature Lagria beetles
Online publication date:	9-Feb-2023
Year of first publication:	2023
Language:	english
Abstract:	Almost all macroorganisms engage in partnerships with microorganisms, which facilitated not only their origin and evolution but have also great impact on their ecology. Microbial symbionts play important roles in the web of life, by taking over tasks essential for survival or development of their hosts. Of those, defense against natural enemies is a challenge for all animals on Earth, including insects. Although insects have evolved numerous traits to cope with different kinds of natural enemies on their own, their association with symbiotic microbes opened up new opportunities to adapt to challenges occurring with antagonistic encounters. This dissertation focuses on the defensive symbiosis between darkling beetles of the genus Lagria (Coleoptera: Tenebrionidae) and several defensive symbionts including Burkholderia bacteria (Pseudomonadota: Betaproteobacteria). Lagria beetles accommodate their symbionts throughout development. They begin their journey in accessory glands of the adult female reproductive system, after which they are applied within a secretion onto the egg surface during oviposition and colonize three peculiar dorsal cuticular invaginations in the larvae. On the eggs, symbionts produce antimicrobial compounds to protect the egg stage against fungal infections from the environment. In larvae both sexes carry the symbionts, while male adults do not contain symbionts, indicating that the symbionts fulfill an important function also in post-hatch stages, which might be antifungal defense as well. With this hypothesis, the aim of this thesis was to investigate the symbiosis in the developing life stages of two Lagria species, L. villosa and L. hirta. Therefore, I intended to (i) elucidate the abundance, composition, and localization of several symbiont strains across host development, (ii) investigate the defensive potential of several members of the symbiont community in different life stages, and (iii) examine the morphological modifications of the beetles for symbiont transmission and maintenance throughout molting and metamorphosis. Bacterial community analyses via 16S amplicon sequencing (Illumina) and qPCR of L. villosa and L. hirta revealed that the beetles are consistently associated with their symbionts throughout all life stages. Moreover, they harbor a diverse community, which predominantly consists of Burkholderia strains, while also symbionts of other families are consistently present in lower abundance. In L. villosa, one Burkholderia strain (LvStB) is highly abundant in the community of all life stages. Despite its reduced genome and metabolic capacities, and its putative immotility compared to other Burkholderia strains, it dominates and is often found as the only Burkholderia strain. Its ability to produce the antifungal compound lagriamide is therefore a potential key factor for its stability and leading role in the beetle. Meanwhile in L. hirta, the two strains LhStH and LhStG dominate the community in varying abundances across the different life stages, proving that also closely related symbiont strains can coexist within single individuals, likely through functional complementation of defensive traits. Histological sections, fluorescence in situ hybridizations (FISH), light sheet microscopy, and micro-computed tomography (µCT) revealed that the symbionts are housed in three pouches of the dorsal thorax in larvae, which are needed for colonization and undergo morphological changes in the pupal stage. The symbiotic organs are formed through invaginations of the cuticle but remain open to the outer surface through a channel and are maintained throughout larval development. Through this channel, symbionts can be internalized after hatching from the egg, ensuring a vertical transmission route, but they can also be released to the outer surface. In pupae, a morphological dimorphism of the organs in females and males leads to a decline of symbionts during pupation in males and ultimately to the complete loss in male adults. For female pupae, the localization on the outer surface enables successful vertical symbiont transmission independent of the reorganization process of the internal tissue during metamorphosis. In vitro and in vivo assays, FISH and MALDI-imaging revealed that the symbionts and lagriamide are not only present inside the symbiotic organs, but also on the surface, where they protect young larvae against pathogenic fungi. On the surface, they inhibit fungal infestation on pupae and larvae, leading to higher larval survival probability. Keeping ectosymbionts accessible to the surface illustrates an effective defense strategy for the beetles against infections from fungal enemies. Furthermore, HPLC-MS, in vivo assays, and genome analyses revealed that in addition to its importance and consistent production in L.  villosa, a close relative of lagriamide, namely lagriamide  II, seems to be similarly responsible for the egg protection in L. hirta. However, lagriamide and their producers are not the only defensive symbionts, but also other Burkholderia strains protect the larval (LvStA) or egg stage (LvStA, LhStG) and have the metabolic capabilities for various protective compounds. Additionally, at least three non-Burkholderia symbionts (AcinetobacterLv1, LuteibacterLv2, VariovoraxLv3) showed protective capabilities on the eggs and through the presence of candidate biosynthetic gene clusters in their genomes their potential for defense. With this thesis, I explored missing links in the developmental stages of the Lagria host and contributed to the general knowledge of defensive symbioses through several aspects: By shedding light on the structure, development, and function of the symbiotic organs, a unique morphological adaptation for insects to tie and maintain symbionts throughout development and host generations was revealed. The open structure of the cuticular invaginations housing antibiotic-producing ectosymbionts exemplifies an effective defense strategy for insects against fungal infections, especially during vulnerable phases of molting and metamorphosis. Moreover, their open structure allows for the horizontal acquisition of other putative symbionts, keeping the association flexible to potentially respond quickly to changing environments. This flexibility is furthermore reflected by the presence and coexistence of multiple protective symbionts next to dominant strains with different metabolic capabilities. Whether multiple symbiont infections are advantageous for the host and symbiont, and how they can persist in a long-term relationship are evolutionary interesting questions that can be further addressed in the Lagria symbiosis. Nahezu alle Makroorganismen gehen in der Natur Partnerschaften mit Mikroorganismen ein. Diese Verbindungen ermöglichten nicht nur die Entstehung und Evolution verschiedenster Arten, sondern können sich auch auf deren Ökologie auswirken. Mikrobielle Symbionten spielen deswegen eine wichtige Rolle im Netz des Lebens, indem sie für ihren Wirt überlebens- oder entwicklungsnotwendige Aufgaben übernehmen. Hierbei ist die Verteidigung gegen natürliche Feinde eine Herausforderung, der sich alle Tiere auf der Erde stellen müssen, einschließlich der Insekten. Und obwohl Insekten selbst zahlreiche Eigenschaften entwickelt haben, um mit verschiedenen Arten von Antagonisten umzugehen, eröffneten Partnerschaften mit symbiotischen Mikroorganismen neue Möglichkeiten, sich an verschiedenste natürliche Feinde anzupassen. Diese Dissertation konzentriert sich auf die Abwehrsymbiose zwischen Wollkäfern der Gattung Lagria (Coleoptera: Tenebrionidae) und mehreren Verteidigungssymbionten, einschließlich Burkholderia-Bakterien (Pseudomonadota: Betaproteobacteria). Die Symbionten begleiten ihre Wirtstiere während der gesamten Entwicklung vom Ei bis zum adulten Käfer. Sie beginnen ihre Reise im weiblichen Käfer in akzessorischen Drüsen des Fortpflanzungssystems, wonach sie während der Eiablage in einem Sekret auf die Eioberfläche geschmiert werden und in den Larven drei einzigartige dorsale Einstülpungen der Kutikula besiedeln. Auf den Eiern produzieren sie antimikrobielle Verbindungen, um die Eier vor Pilzinfektionen aus der Umwelt zu schützen. In Larven tragen beide Geschlechter die Symbionten, während erwachsene männliche Käfer keine Symbionten mehr haben. Dies deutet darauf hin, dass die Symbionten womöglich auch nach dem Schlüpfen aus dem Ei eine wichtige Funktion für ihren Wirt erfüllen, nämlich weiteren Schutz gegen Pilzbefall aus der Umwelt. Mit dieser Hypothese war das Ziel dieser Arbeit, die Symbiose in den weiteren Lebensstadien zweier Wollkäferarten, L. villosa und L. hirta, zu untersuchen. Daher wollte ich (i) die Häufigkeit, Zusammensetzung und Lokalisation mehrerer Symbiontenstämme über verschiedene Lebensstadien des Wirts hinweg analysieren, (ii) das Verteidigungspotenzial mehrerer Mitglieder der Symbiontengemeinschaft in verschiedenen Lebensstadien untersuchen und (iii) die morphologischen Anpassungen der Käfer für die Übertragung und Aufrechterhaltung der Symbionten während der Häutung und Metamorphose betrachten. Analysen der Bakteriengemeinschaft mittels 16S-Amplikon-Sequenzierung (Illumina) und qPCR zeigten, dass die Käfer durchweg in allen Lebensstadien mit ihren Symbionten assoziiert sind. Darüber hinaus beherbergen sie eine vielfältige Gemeinschaft, die überwiegend aus Burkholderia-Stämmen besteht, wobei auch Symbionten anderer Familien in geringeren Mengen vorhanden sind. Bei L. villosa kommt ein Burkholderia-Stamm (LvStB) besonders häufig vor. Trotz seines reduzierten Genoms und seiner vermeintlichen fehlenden Fähigkeit zur Motilität dominiert er in Anwesenheit anderer Burkholderia-Stämme und ist oft als einziger Burkholderia-Stamm im Wirt zu finden. Seine Fähigkeit, den antimykotischen Wirkstoff Lagriamid zu produzieren, ist vermeintlich ein potenzieller Schlüsselfaktor für seine Konstanz und führende Rolle im Käfer. Währenddessen dominieren bei L. hirta zwei Stämme, LhStH und LhStG, die Gemeinschaft, obgleich in unterschiedlicher Häufigkeit in den verschiedenen Lebensstadien. Dies beweist, dass auch eng verwandte Symbiontenstämme innerhalb einzelner Individuen koexistieren können, wahrscheinlich durch funktionelle Ergänzung der unterschiedlichen Abwehrsubstanzen. Histologische Schnitte, Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierungen (FISH), Lichtscheibenmikroskopie und Mikro-Computertomographie (µCT) zeigten, dass die Symbionten in drei Einstülpungen des dorsalen Thorax in Larven untergebracht sind. Die symbiotischen Organe werden durch Einstülpungen der Kutikula gebildet, bleiben aber durch einen Kanal zur Außenfläche offen und sind während der gesamten Larvenentwicklung erhalten. Durch diesen Kanal können Symbionten nach dem Schlüpfen aus dem Ei aufgenommen werden, was einen vertikalen Übertragungsweg gewährleistet. Über diesen Weg können sie auch an die äußere Oberfläche der Larven gelangen. Bei Puppen unterscheiden sich diese Organe in Weibchen und Männchen. Eine Verkleinerung der Organe bei Männchen führt zu einem Rückgang der Symbionten während der Verpuppung und schließlich zum vollständigen Verlust im männlichen Erwachsenen. Bei weiblichen Puppen ermöglicht die Erhaltung dieser Organe eine erfolgreiche vertikale Symbiontenübertragung sogar über den Reorganisationsprozess des inneren Gewebes während der Metamorphose. In-vitro- und in-vivo-Assays, FISH und MALDI-Bildgebung zeigten, dass die Symbionten und Lagriamid nicht nur innerhalb der symbiotischen Organe vorkommen, sondern auch auf der Oberfläche, wo sie junge Larven vor pathogenen Pilzen schützen. An der Oberfläche hemmen sie den Pilzbefall auf Puppen und Larven, was zu einer höheren Überlebenswahrscheinlichkeit der Larven führt. Ektosymbionten an der Oberfläche zu binden, veranschaulicht eine effektive Verteidigungsstrategie der Käfer gegen Infektionen durch Pilzfeinde. Darüber hinaus zeigten HPLC-MS, in-vivo-Assays und Genomanalysen, dass neben seiner Bedeutung und beständigen Produktion in L. villosa ein naher Verwandter von Lagriamid, nämlich Lagriamid II, in ähnlicher Weise für den Eischutz in L. hirta verantwortlich zu sein scheint. Lagriamid und ihre Produzenten sind jedoch nicht die einzigen Abwehrmechanismen, denn auch andere Burkholderia-Stämme und deren Schutzstoffe schützen das Larven- (LvStA) oder Eistadium (LvStA, LhStG) gegen Pilzbefall. Darüber hinaus zeigten mindestens drei andere bakterielle Symbionten (Acinetobacter-Lv1, Luteibacter-Lv2, Variovorax-Lv3) Abwehrfähigkeiten gegenüber den Eiern und durch das Vorhandensein von potenziellen biosynthetischen Genclustern in ihren Genomen auch ihr Verteidigungspotenzial. Mit dieser Arbeit erforschte ich fehlende Bindeglieder in den Entwicklungsstadien der Wollkäfer und trug durch mehrere Aspekte zum allgemeinen Wissen über Verteidigungssymbiosen bei: Indem ich die Struktur, Entwicklung und Funktion der symbiotischen Organe beleuchtete, deckte ich eine einzigartige morphologische Anpassung für Insekten auf, um Symbionten während der gesamten Entwicklung und Wirtsgenerationen zu binden und zu erhalten. Die offene Struktur der kutikulären Einstülpungen, die antibiotikaproduzierende Ektosymbionten beherbergen, veranschaulicht eine effektive Verteidigungsstrategie für Insekten gegen Pilzinfektionen, insbesondere während anfälliger Phasen der Häutung und Metamorphose. Darüber hinaus lässt ihre offene Struktur einen Spielraum für den potenziellen horizontalen Erwerb anderer mutmaßlicher Symbionten, wodurch die Symbiose flexibel bleibt, um potenziell schnell auf Umweltveränderungen reagieren zu können. Diese Flexibilität spiegelt sich außerdem in der Anwesenheit und Koexistenz mehrerer schützender Symbionten neben dominanten Stämmen mit unterschiedlichen Stoffwechselfähigkeiten wider. Ob eine Vielzahl an koexistierenden Symbionten für die Symbiose vorteilhaft ist und wie diese in einer langfristigen Beziehung bestehen können, sind evolutionär interessante Fragen, die durch das Lagria-System weiter untersucht werden können.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics 570 Biowissenschaften 570 Life sciences 590 Tiere (Zoologie) 590 Zoological sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-8654
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-ddd6c59d-6598-4ab2-b28d-779712c629fa8
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	VIII, 160, VI Seiten ; Illustrationen, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen