Authors:	Uebbing, Lukas Christian Jürgen
Title:	Structural and functional characterization of lipid-based mRNA delivery systems
Online publication date:	15-Feb-2023
Year of first publication:	2023
Language:	english
Abstract:	Pharmaceutical research has progressed in rapid manner over the last century. It has seen a shift from small molecule drugs to so called biologicals, which comprise macromolecules (such as proteins or nucleic acids) and have led to significant advantages in some therapeutic fields, such as several forms of cancer, by enabling the possibility of cancer immunotherapy. This therapeutical concept is based on utilizing the body’s own defense mechanisms to combat the mutated cancer cells by training the immune system to recognize tumor antigens, which can for example be achieved through transfection of antigen presenting cells with the tumor antigen by delivering nucleic acids coding for this antigen into these cells. Traditionally, viral vectors have often been used to transfect target cells with genetic information. However, several problems (such as antiviral immune responses against the vector) come with the use of these delivery systems. Therefore, several approaches have been developed to mimic viral vectors while trying to reduce their downsides. One of these approaches is the use of lipid-based nanosized delivery systems, which are called lipoplexes or lipid nanoparticles (LNPs). Recent years have seen the first approvals of lipid-based delivery systems delivering nucleic acid drug molecules. However, while a lot of effort has been spent on efficacy studies – be it in vitro or in vivo – and on general physicochemical characterization of lipid-based nanomedicines for mRNA delivery in cancer immunotherapy or other applications, a lack of insight into the internal structures, their transformation in relation to environmental changes, and the implications thereof still remains. This thesis therefore gives accurate in situ insights into the structural organization of lipid-based mRNA delivery systems – be it lipoplexes or LNPs – by utilizing potent and seldom applied characterization methods in the form of small angle scattering techniques, as well as traditional nanoparticle and nucleic acid characterization tools such as dynamic light scattering, fluorescence-based pKa determination, microscopy, zeta potential measurements, nucleic acid encapsulation assays, and in vitro transfection efficacy. This enables the confirmation and optimization of previously established models to describe the internal structures and changes thereof more accurately in terms of both formulation and environmental parameters. New models are developed describing the pH-responsiveness of both lipoplexes and lipid nanoparticles, as well as the differences between these kinds of RNA delivery systems. Additionally, a first attempt to draw conclusions about a structure-function relationship is made. Overall, the results described within this thesis should therefore provide better understanding of the functional and structural coherencies inside lipid-based mRNA delivery systems, which will help in the intelligent design and fine-tuning of the next generation of delivery systems during this just beginning new era of nucleic acid drug products. Im Laufe des letzten Jahrhunderts hat sich die pharmazeutische Forschung in hohem Tempo weiterentwickelt. Dabei wurde eine Verschiebung weg von traditionellen Produkten, mit kleinen Molekülen als Wirkstoffen, hin zu sogenannten Biologicals, welche Makromoleküle wie beispielsweise Proteine oder Nukleinsäuren enthalten, offensichtlich. Diese Produkte führten zu signifikanten Verbesserungen in mehreren Therapiegebieten, wie beispielsweise verschiedenen Krebsformen, indem sie das Prinzip der Krebs-Immuntherapie ermöglichten. Dieses therapeutische Konzept basiert darauf, körpereigene Abwehrmechanismen bei der Bekämpfung der mutierten Krebszellen zu nutzen, indem das Immunsystem auf die Erkennung von Tumorantigenen trainiert wird. Dies kann beispielsweise durch die Transfektion von antigenpräsentierenden Zellen mit dem Tumorantigen erfolgen, indem antigencodierende Nukleinsäuren in die Zielzellen eingebracht werden. Traditionell wurden hierfür virale Vektoren genutzt, allerdings bringen diese verschiedene Problematiken (wie beispielsweise antivirale Immunreaktionen gegen den Vektor) mit sich. Aufgrund dessen wurden verschiedene Ansätze entwickelt, um die viralen Vektoren nachzuahmen und deren Nachteile zu umgehen. Einen dieser Ansätze stellt die Nutzung von lipidbasierten nanopartikulären Freigabesystemen dar. Diese Systeme werden auch Lipoplexe oder Lipidnanopartikel (LNP) genannt. Die ersten lipidbasierten Nukleinsäure-Freigabesysteme wurden im Verlauf der letzten Jahre zugelassen. Obwohl dabei ein großes Augenmerk auf Effektivitätsstudien – egal ob in vitro oder in vivo – und auf generelle physikochemische Charakterisierung der lipidbasierten mRNA Freigabesysteme für die Krebstherapie (oder andere Applikationen) gelegt wurde, blieben die internen Strukturen, deren Veränderungen als Reaktion auf Umwelteinflüsse und die Folgen dieser Strukturen und Reaktivitäten relativ wenig erforscht und sind daher häufig noch unzureichend erklärt. Daher beschäftigt sich diese Arbeit mit in situ Einblicken in den strukturellen Aufbau von lipidbasierten mRNA-Freigabesystemen (Lipoplexe und LNPs), indem sowohl potente und selten genutzte Charakterisierungsmethoden in Form von Kleinwinkelstreumethoden als auch traditionelle Nanopartikel- und Nukleinsäure-Charakterisierungsexperimente wie beispielsweise dynamische Lichtstreuung (DLS), fluoreszenzbasierte pKa-Bestimmung, Mikroskopie, Zeta-Potential Messung, Bestimmung der Nukleinsäuren-Einschlussrate und Transfektionsexperimente angewendet werden. Dies ermöglicht die Bestätigung und Optimierung eines bereits beschriebenen Modells zur Beschreibung der internen Struktur von Lipoplexen und ihrer Veränderung in Abhängigkeit von Formulierungs- und Umweltparametern. Des Weiteren werden neue Modelle erarbeitet, die die pH-Responsivität von Lipoplexen und Lipidnanopartikeln sowie die Unterschiede zwischen diesen beiden Arten von mRNA-Freigabesystemen beschreiben. Außerdem wird versucht, erste Struktur-Wirkungszusammenhänge zu erörtern. Zusammengefasst ermöglichen die Ergebnisse, die in dieser Dissertation erarbeitet werden, die funktionellen und strukturellen Zusammenhänge in lipidbasierten mRNA-Freigabesystemen besser zu verstehen, was beim intelligenten Design und der Verbesserung der nächsten Generationen von Freigabesystemen in diesem neuen Zeitalter der nukleinsäurebasierten Arzneimittel eine wichtige und hilfreiche Rolle spielen wird.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-8447
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-0a405820-cb04-4489-9309-e31310abf1441
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	XIV, 146 Seiten ; Illustrationen, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen