Authors:	Reich, Thomas R.
Title:	The role of inhibitor of apoptosis proteins and XAF1 in the resistance to anti-cancer treatment in brain tumor cells and high-grade gliomas
Online publication date:	19-May-2017
Year of first publication:	2017
Language:	english
Abstract:	Einleitung: Hochgradige Gliome (WHO Grad III und IV) stellen die häufigste und aggressivste Tumorform unter den Hirntumoren dar. Besonders Glioblastome (Grad IV) sind mit einer äu ßerst schlechten Prognose assoziiert und sind kaum therapierbar. Daher ist die Erforschung von prognose oder therapieassoziierten Marker unabdingbar. Inhibitor of apoptosis proteins (IAPS) sind in der Regulation der Apoptose beteiligt und in Tumoren häufig überexprimiert. Die wohl wichtigsten IAP Vertreter Survivin und X linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) sind mitverantwortlich für die maligne Transformation von Zellen, die Tumorprogression und die Resistenzbildung gegenüber zytostatikainduzierter Apoptose. Die Inhibierung dieser IAPs kann durch das pro apoptotische Tumorsuppressorprotein XIAP associated factor 1 (XAF1) er folgen, welches seinerseits häufig in verschiedenen Tumorentitäten herunterreguliert ist. Methoden: Zur Analyse des zellulären Überlebens wurden Koloniebildungstests und Zellviabi litätstests in Abhängigkeit von ektopischer Survivin Expression durchgeführt. In diesem hier etablierten Zellmodell wurden außerdem die Induktion von Apoptose/ Nekrose, Seneszenz, DNA Schäden und der DNA Reparaturkapazität in Abhängigkeit von der subzellulären Survivin Lokalisation bestimmt. Die epigenetische Regulation von survivin und XAF1 wurde mittels me thylierungsspezifischer PCR und high resolution melt Analyse untersucht. Um den Einfluss bei der epigenetischen Faktoren auf das Überleben von Gliompatienten zu ermitteln, wurden Ka plan Meier Überlebenszeitanalysen durchgeführt. Ergebnisse: Zytoplasmatisch lokalisiertes Survivin vermittelte in den hier durchgeführten Ex perimenten eine Resistenz gegenüber dem alkylierenden Zytostatikum Temozolomid (TMZ). Nach der Überexpression von Survivin konnte ein stark verbessertes Überleben und eine Re duktion des Anteils seneszenter Zellen beobachtet werden. Beides konnte auf eine signifikant reduzierte Zahl an DNA Doppelstrangbrüchen und eine erhöhte DNA Reparaturkapazität zu rückgeführt werden. Dagegen blieb dieser protektive Effekt in Zellen, in denen Survivin im Kern lokalisiert war, aus. Zur Evaluation von survivin und XAF1 als potentielle Biomarker in hochgradigen Gliomen wurde die epigenetische Stilllegung beider Promotorregionen unter sucht. Während für survivin keine epigenetische Regulation beobachtet werden konnte, wurde für XAF1 eine eindeutige, inverse Korrelation zwischen der Promotormethylierung und der XAF1 mRNA und Protein Expression festgestellt. Ein methylierter XAF1 Promotor war po sitiv mit dem Überleben von Gliompatienten (Grad III) assoziiert und trat in dieser Tumoren tität strikt in Zusammenhang mit einer Mutation im IDH1 Gen auf, welche ein gut etablierter Biomarker für hochgradige Glioma darstellt. Diskussion: In der vorliegenden Arbeit konnte eine neuartige Rolle von Survivin bei der Repa ratur von TMZ induzierten Doppelstrangbrüchen über die Homologen Rekombination be schrieben werden. Dies war stark abhängig von der Lokalisation des Proteins. Die Information über die Expression und Lokalisation von Survivin in Gliomen könnte daher einen vielverspre chenden molekularen Marker darstellen. Die prognostische Bedeutung der Methylierung des XAF1 Promotors wurde für Grad III Gliome nachgewiesen und könnte aufgrund seiner strikten Assoziierung mit Mutationen im IDH1 Gen zur Unterstützung der Prognose und der Vorher sage des Therapieansprechens herangezogen werden. Introduction: High grade gliomas (HGG) are the most frequent and most aggressive type of brain tumors with WHO grade III and IV. Especially gliomas of grade IV (glioblastomas) remain incurable and are associated with a short median survival. Therefore, there is an urgent need for improving the understanding of biological markers involved in pathogenesis and therapy response of gliomas. Inhibitor of apoptosis proteins (IAPs) are essential for regulation of apop tosis. Particularly Survivin and the X linked inhibitor of apoptosis protein (XIAP) are strongly expressed in many tumors, driving malignant transformation, tumor progression, and most importantly enabling tumor cells to resist therapy induced apoptosis. In turn, IAPs are regu lated themselves by pro apoptotic factors, amongst which the XIAP associated factor 1 (XAF1) is an important tumor suppressor, frequently downregulated in different tumor entities. Methods: Cellular survival was analyzed by colony formation assay and cell viability assays in the background of ectopic Survivin overexpression in glioma cells. In this here established cell model, induction of apoptosis, necrosis, senescence, DNA damage, and DNA repair capacity was investigated depending on the subcellular localization of Survivin. The epigenetic regula tion of survivin and XAF1 was analyzed in glioma cells and HGG patient samples by methylation specific PCR and methylation sensitive high resolution melt analysis. Kaplan Meier survival estimates were calculated to determine survival differences in dependency of the XAF1 meth ylation status in HGG patients. Results: Predominantly cytoplasmic Survivin was found to mediate cellular resistance to the alkylating anti cancer drug temozolomide (TMZ). Upon overexpression, Survivin led to an im proved cellular survival and a reduced proportion of senescent cells. Both observations could be linked to a lower induction of DNA damage (double strand breaks) that was caused by an increased homologous recombination repair (HRR) capacity. In contrast, cells with overexpres sion of mutant Survivin, accumulating within the cell nucleus, sensitized the cells towards the applied treatment and were associated with increased DNA damage and an impaired HRR ac tivity. In search for putative biomarkers, the methylation in the promoter regions of survivin and XAF1 was analyzed. In glioma cells, no clear gene regulation of survivin by promoter meth ylation was observed. However, CpG methylation in the XAF1 promoter was found to be in versely correlated with XAF1 mRNA and protein expression and furthermore to a strongly im proved survival of patients with grade III gliomas. In these tumors, the occurrence of XAF1 methylation was strictly associated to a specific mutation in the IDH1 gene, which is widely used as prognostic marker for HGG. Discussion: Here, a yet unknown participation of Survivin in the HRR is described in the re sponse to TMZ. It was shown that this protective effect relies on the intracellular localization of Survivin. Thus, the expression and localization of Survivin might provide valuable infor mation about the prognosis and the response to chemotherapy in HGG. Furthermore, XAF1 methylation was determined as a prognostic marker for grade III gliomas, being associated with an improved survival and IDH1 mutations. Thus, analyzing this factor may improve the accuracy of the prognosis in HGG and eventually predict the response to TMZ based therapy.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 04 Medizin
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-838
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000013122
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	VI, 168 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen