Authors:	Hellmuth, Isabell
Title:	Functionally modified (Deoxy)Ribonucleotides : synthesis and study of physicochemical and biological properties
Online publication date:	16-May-2017
Year of first publication:	2017
Language:	english
Abstract:	Understanding and controlling the role of RNA in processes of human health and disease, apart from basic cellular mechanisms, is of immense value. Many severe cases are still in need for optimized therapy strategies, a gap, which could be filled in the near future by promising therapeutic RNA applications. Especially the design of tailored siRNA and mRNA strategies towards personal therapy presents an encouraging point of vantage. The development of such techniques requires fundamental knowledge concerning physicochemical properties of RNA, as the implementation of molecular changes could influence the resulting biological activity in manifold directions. The first project of the current thesis addressed this issue in assessing the influence of a terminal alkyne attached to the exocyclic amine of 2’-O-deoxycytidine phosphoramidites, which were applied in solid phase DNA synthesis of 22mers, exhibiting an analogous sequence to an eGFP-siRNA sense strand. The preferred orientation of this functional group and its influence on duplex stability were investigated via 2D-NMR spectroscopy and temperature dependent UV-absorption melting experiments, revealing significant changes of stability in the case of a double modified 5-methyl-2’-O-deoxycytidine. Additionally, the terminal alkyne served as a handle for the copper-I-catalyzed azide-alkyne cycloaddition (CuAAC) with a fluorescent dye. Driven by the latest insights on the molecular mechanisms of TLR7 and 8 activation, which were suggested to be activated via two distinct triggers and pathways, the idea was born to address them simultaneously with one molecule combining both activating patterns, a small molecule TLR agonist and a single-stranded RNA, in one bidentate ligand to manipulate the innate immune system. To this end, the bioorthogonal CuAAC should present again the method of choice to link the desired molecules. Therefore, two small molecules of the imidazoquinoline family were prior equipped synthetically with azide-linkers for immobilization on designed functional alkyne-bearing mRNA molecules. The focus of this study was on the evaluation of cytokine release by human immune cells under the influence of the created new smTLRa-mRNA conjugates and their respective building blocks. Besides the described long and coding mRNAs, investigations involved also the modification and application of siRNA-conjugates, representing short non-coding RNAs. Bearing a potential therapeutic application in mind, which would involve the original function of the applied RNA species, as part of the translational machinery and RNAi mediated expression control, effects by the implemented RNA-modulations on these biological properties were investigated. Die Rolle von RNA bezüglich physiologischer und pathologischer Prozesse, neben grundlegenden zellulären Mechanismen, zu verstehen und kontrollieren zu können, ist von unschätzbarem Wert. Einer Vielzahl schwerwiegender Krankheiten bedarf es immer noch an optimierten Therapieansätzen, eine Lücke, die in Zukunft durch vielversprechende therapeutische Ansätze mittels RNA gefüllt werden könnte. Besonders das Design maßgeschneiderter siRNA und mRNA Strategien hin zu personeller Therapie stellt einen aussichtsreichen Angriffspunkt dar. Die Entwicklung solcher Techniken bedarf grundlegendem Wissen im Hinblick auf physikochemische Eigenschaften der RNA, da die Durchführung molekularer Veränderungen die resultierende biologische Aktivität in vielerlei Hinsicht beeinflussen kann. Das erste Projekt der vorliegenden Arbeit adressierte dies durch die Evaluation eines, an das exo-zyklische Amin von Desoxycytidin-Phosphoramiditen angebrachte, terminalen Alkins. Diese Bausteine wurden in der DNA Festphasensynthese von 22meren, welche die Sequenz eines eGFP-siRNA sense-Stranges aufwiesen, angewendet. Die bevorzugte Orientierung dieser funktionalen Gruppe und deren Einfluss auf die Doppelhelix Stabilität wurden mittels 2D-NMR Spektroskopie und Temperatur abhängigen UV-Absorptions-Schmelzexperimenten untersucht, wobei signifikante Veränderungen in der Stabilität im Fall eines doppelt modifizierten 5-Methyldesoxycytidines beobachtet werden konnten. Zudem, wurde die Funktion des terminalen Alkins in der Kupfer(I)-katalysierten Azid-Alkin Cykloaddition mit einem Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt. Aktuelle Erkenntnisse zu molekularen Mechanismen zur Adressierung von TLR7 und 8, deren Aktivierung über zwei verschiedene Auslösemechanismen vermutet wird, bedingten die Idee diese beiden Pfade durch ein Molekül anzusprechen, welches beide Aktivierungsstrukturen, also einen niedermolekularen TLR Liganden (smTLRa) und eine einzelsträngige RNA, miteinander kovalent verbindet um das angeborene Immunsystem zu manipulieren. Zu diesem Zweck wurde die bioorthogonale CuAAC Reaktion gewählt um die anvisierten Moleküle zu verbinden. Daher wurden zuvor zwei niedermolekulare Immunmodulatoren der Imidazochinolin-Familie synthetisch mit Azid-Linkern für die Anbringung an, ebenfalls designte, funktionelle mRNA versehen. Der Fokus dieser Studie lag auf der Evaluation der, durch humane Immunzellen ausgeschütteten, Zytokine unter dem Einfluss der neu designten smTLR-mRNA Konjugate und deren Bausteine. Neben der beschriebenen langen und kodierenden mRNA, beinhalteten die Untersuchungen ebenfalls die Modifizierung und Anwendung kleiner siRNA Konjugate. Eine potentielle therapeutische Anwendung im Hinterkopf habend, welche die ursprüngliche Funktion der eingesetzten RNA Spezies, als Teil der translationalen Maschinerie und der RNAi bedingten Expressionskontrolle, beinhaltet, wurden die Effekte der durchgeführten RNA-Modulationen bezüglich ihrer biologischen Eigenschaften untersucht.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-832
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-diss-1000013032
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	https://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	xxii, 139 Seiten
Appears in collections:	JGU-Publikationen