Authors:	Peters, Katharina Astrid
Title:	Herstellung eines funktionalen Mundschleimhaut-Äquivalents zur personalisierten Gewebe-Rekonstruktion
Online publication date:	24-Oct-2022
Year of first publication:	2022
Language:	german
Abstract:	In der rekonstruktiven Chirurgie stellt eine in vitro-generierte Mundschleimhaut als Transplantat bei Gewebedefekten eine Alternative zu autologem Gewebe dar. Diese Arbeit befasste sich mit der Herstellung und Analyse eines funktionalen Mundschleimhaut-Äquivalents zur personalisierten Gewebe-Rekonstruktion. Dabei wurde die Ausbildung einer effizienten Blutgefäßversorgung des Gewebes (Prävaskularisierung) sowie die Stimulation der Epithelausbildung angestrebt. Für die Herstellung des Mundschleimhaut-Äquivalents wurden primäre Fibroblasten, Endothelzellen und Epithelzellen aus Patientinnen- und Patienten-Gewebe isoliert und als Tri-Kultur auf einer Kollagenmatrix kultiviert. Damit die Herstellung des Gewebe-Äquivalents in einer klinischen Anwendung individuell an die Patientinnen und Patienten angepasst werden kann, wurde die Verwendung von endothelialen kolonieformenden Vorläuferzellen (ECFC) aus Vollblut mit der etablierten Anwendung von humanen dermalen mikrovaskulären Endothelzellen (HDMEC) aus juveniler Vorhaut verglichen. Bei der Analyse der interzellulären, parakrinen Kommunikation zeigte sich, dass die Kultivierung mit Epithelzellen im Mundschleimhaut-Äquivalent eine Herunterregulierung der Sekretion einer Vielzahl verschiedener Zytokine, wie VEGF, eNOS und Angiopoietin-2 verursachte. Es ließ sich kein wesentlicher Unterschied zwischen HDMEC und ECFC feststellen. Trotz der geringeren Zytokin-Verfügbarkeit bildete sich durch die Fibroblasten eine extrazelluläre Matrix aus. Die HDMEC erzeugten an Kulturtag 33 eine oberflächliche Prävaskularisierung der Kollagenmatrix. Zur Erzeugung einer tiefen Vaskularisierung sollte ein chemotaktischer Reiz mittels kontrolliertem Aufbruch von Wachstumsfaktor-beladenen Nanopartikeln gesetzt werden, was sich jedoch als nicht anwendbar herausstellte. Die potenzielle Gewebeintegration wurde in ovo untersucht. Die oberflächliche Prävaskularisierung unterstützte die Epithelausbildung und -Erhaltung des Mundschleimhaut-Äquivalents in ovo. Dabei zeigten die ECFC ein vergleichbares Verhalten wie die HDMEC. Eine Prävaskularisierung kann somit auch mit ECFC erreicht werden. An Kulturtag 33 zeigte sich eine deutliche Epithelschicht. Eine Basalmembran war ohne eine zusätzliche Stimulation nicht nachweisbar. Durch die Anwendung einer extrakorporalen Stoßwellentherapie (ESWT) an Kulturtag 19 konnte die in vitro-Ausbildung der Basalmembran sowie eine stärkere Ausprägung und Differenzierung des Epithels unterstützt werden. Bei Bi-Kulturen mit Fibroblasten und Epithelzellen führte die in vitro-Anwendung der ESWT zu einer besseren Epithelerhaltung während der in ovo-Kultivierung im Vergleich zu unbehandelten Kulturen. Bei prävaskularisierten Mundschleimhaut-Äquivalenten führte die ESWT-Anwendung allerdings zu einer gegenseitigen Hemmung der Endothelzellen und der Epithelzellen in ovo. Eine erfolgreiche Kombination der Prävaskularisierung und der ESWT-Anwendung könnte das effiziente Einwachsen, Überleben und die Funktionalität des Mundschleimhaut-Äquivalents in in vivo-Anwendungen gewährleisten. Insgesamt konnte im Rahmen dieser Arbeit eine deutliche Verbesserung von patientinnen- und patientenindividuellen Mundschleimhaut-Äquivalenten für den autologen Gewebeersatz erzielt werden. In reconstructive surgery, an in vitro generated oral mucosa represents an alternative to autologous tissue as a graft for tissue defects. This work addressed the generation and analysis of a functional oral mucosa equivalent for personalized tissue reconstruction. The aim was the formation of an efficient blood vessel supply to the tissue (prevascularization) as well as the stimulation of epithelial formation. To produce the oral mucosa equivalent, primary fibroblasts, endothelial cells and epithelial cells were isolated from patient tissue and cultured as tri-culture on a collagen matrix. To allow the generation of the tissue equivalent in a clinical application to be individually adapted to the patients, the use of endothelial colony-forming progenitor cells (ECFC) from whole blood was compared with the established use of human dermal microvascular endothelial cells (HDMEC) from juvenile foreskin. Analysis of intercellular paracrine communication revealed that culturing with epithelial cells in the oral mucosal equivalent caused downregulation of secretion of a variety of different cytokines, including VEGF, eNOS, and angiopoietin-2. No significant difference could be detected between HDMEC and ECFC. Despite the lower cytokine availability, an extracellular matrix was formed by the fibroblasts. The HDMEC produced superficial prevascularization of the collagen matrix at culture day 33. To generate deep vascularization, a chemotactic stimulus should be applied using controlled disruption of growth factor-loaded nanoparticles, but this proved not to be applicable. Potential tissue integration was investigated in ovo. Superficial prevascularization supported epithelial formation and maintenance of the oral mucosa equivalent in ovo. In this regard, ECFC showed comparable behavior to HDMEC. Thus, prevascularization can also be achieved with ECFC. On culture day 33, a distinct epithelial layer was evident. A basement membrane was not detectable without additional stimulation. The application of extracorporeal shock wave therapy (ESWT) on culture day 19 supported the in vitro formation of the basement membrane as well as a stronger expression and differentiation of the epithelium. In bi-cultures containing fibroblasts and epithelial cells, in vitro application of ESWT resulted in better epithelial preservation during in ovo cultivation compared with untreated cultures. However, in prevascularized oral mucosa equivalents, ESWT application resulted in reciprocal inhibition of endothelial cells and epithelial cells in ovo. Successful combination of prevascularization and ESWT application could ensure efficient ingrowth, survival, and functionality of the oral mucosa equivalent in in vivo applications. Overall, this work has significantly improved patient-specific oral mucosa equivalents for autologous tissue replacement.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences 610 Medizin 610 Medical sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-8043
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-7265366b-06d6-4ec5-b82d-4780496dce649
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	In Copyright
Information on rights of use:	http://rightsstatements.org/vocab/InC/1.0/
Extent:	iv, 229 Blätter ; Illustrationen, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen