Authors:	Worm, Matthias
Advisor:	Frey, Holger
Title:	pH-cleavable and hyperbranched polyether architectures: from novel synthesis strategies to applications in nanotechnology and biomedicine
Online publication date:	28-Sep-2022
Year of first publication:	2022
Language:	english
Abstract:	The use of polyethylene glycol (PEG) is diverse, ranging from food technology and cosmetics to applications in nanotechnology and pharmaceutical industries. However, despite the various favorable properties of PEG, its non-degradability and the low number of functional groups can be a drawback to many applications. The aim of this thesis is to establish cleavability of PEG and PEG-derived lipids and surfactants by exploring novel synthetic pathways to incorporate pH-hydrolyzable moieties into the polyether structures. A strong emphasis is put on elucidating the hydrolysis kinetics of the novel materials to evaluate their potential for future applications. Furthermore, hyperbranched polyglycerol (hbPG) architectures are investigated that contain a large number of hydroxyl functionalities, which render hbPGs interesting PEG substitutes if multifunctionality of the polyether is a requirement. Chapter 1.1 serves as an introduction to the chemistry of PEG and presents an overview on various routes to incorporate functional moieties into the backbone or at the chain ends of PEG. A particular focus is directed at the anionic ring-opening polymerization (AROP) of epoxide monomers, which constitutes the fundamental polymerization technique employed in this thesis. Chapter 1.2 represents an introduction into liposome research, which highlights the development of sterically stabilized liposomes (“stealth liposomes”), active cell targeting and stimuli-responsive drug release strategies. Especially, the usefulness of pH-cleavable PEG-lipids in liposomal formulations is illustrated. In Chapter 1.3 block copolymers composed of poly(propylene oxide) (PPO) and PEG (denoted as PEO) are introduced, focusing on the broad range of applications for PEO-b-PPO-b-PEO copolymers (poloxamers) as surfactants and reflecting recent trends in this area. An overview on cleavable PEG architectures is given in Chapter 1.4 summarizing current achievements in addressing the non-degradability of PEG. Problems arising from PEG’s biopersistence are discussed that, for instance, set an upper molecular weight limit of PEG for the use in biomedical applications. Chapters 1.3 and 1.4 are sections of a comprehensive review article that was published in Chemical Reviews. In Chapter 2, the design of pH-cleavable poloxamer analogs (PEO-b-PPO-b-PEO copolymers) is presented that contain acid-sensitive acetal linkages at the block junctions. In a proof-of-concept experiment, the novel amphiphilic polymers were used as surfactants for the miniemulsion polymerization of styrene to prepare well-defined polystyrene nanoparticles. pH-triggered precipitation of these nanoparticles from stable miniemulsions allowed efficient removal of surfactant fragments to obtain additive-free nanoparticles. Separation of surfactants is a major challenge with MEPs, however, is desirable due to environmental concerns and potential surfactant-mediated changes of particle properties. To address the non-degradability of PEG, in Chapter 3 the anionic ring-opening copolymerization of ethylene oxide and 3,4-epoxy-1-butene (EPB) was explored to introduce multiple pH-sensitive vinyl ether moieties in the PEG backbone after catalytic isomerization of the allylic double bonds. Well-defined, acid-cleavable copolymers of tailorable molecular weight with low contents of EPB (4 mol%) were synthesized in an efficient two-step procedure. Analysis of degradation products via SEC indicated moderate molecular weight distribution (Ð = 1.6 – 1.8). Hydrolysis profiles of pH-cleavable P(EPB-co-EG) copolymers were monitored by 1H NMR spectroscopy in a physiologically relevant pH range of 4.4 to 5.4, revealing promising cleavage kinetics with respect to biomedical application, e.g. for cleavable, long-circulating polymer-drug conjugates. The synthesis of pH-sensitive PEG-lipids with in-chain cleavable ketal and acetal units for the application in pH-responsive “stealth” liposomes is reported in Chapter 4. To this end, a novel synthesis strategy towards asymmetric ketals in polymers was developed providing access to PEG-lipids of tunable molecular weights and with a defined hydroxyl end group facilitating post-modification reactions. In situ 1H NMR kinetic studies on the hydrolysis rates of the pure lipids suggested significantly faster cleavage of ketals compared to acetals. The behavior of the lipids in liposomal formulations was further analyzed via time-resolved fluorescence spectroscopy and gel electrophoresis assays to monitor pH-dependent detachment of PEG from the liposomal surface. Highly promising PEG shedding properties in mildly acidic media (pH 5.5 to 6.5) were found for the ketal-functional PEG-lipids that suggest great potential for pH-triggered drug release strategies from liposomes e.g. in tumor therapy. In liposomal research, hbPGs are promising alternatives to PEG as they can convey a multivalence effect in active cell targeting. In order to study the effect of the polyether architecture on liposomal properties, in Chapter 5 dialkyl-functional hbPG- and PEG-lipids were synthesized with molecular weights of 3 to 7 kg mol-1. A novel linPG-lipid precursor offered access to the hbPG-lipids using slow monomer addition of the latent AB2-type monomer glycidol. Liposomes containing linear or hyperbranched lipids were prepared by dual centrifugation. Tuning of the diameter of liposomes in a range below 100 nm could be achieved, which has been proposed as an optimum for antitumor therapy. First in vivo biodistribution studies of 18F-radiolabeled lipids by positron emission tomography (PET) imaging were performed that suggest efficient renal clearance of the PEG-/hbPG-lipids. In addition, blood circulation of radiolabeled, polyether-modified liposomes for more than 1 h was observed, providing evidence for hbPG-mediated “stealth” properties of liposomes in vivo. Polyethylenglykol (PEG) ist ein hydrophiler, aliphatischer Polyether mit einem breiten Anwendungsspektrum in Nahrungsmitteln und Kosmetikartikeln. PEG findet zudem vielfachen Einsatz in der pharmazeutischen Industrie sowie der Nanotechnologie. Trotz der mannigfachen, wertvollen Eigenschaften von PEG stellen in vielen Anwendungen sowohl das chemisch robuste PEG-Rückgrat als auch die geringe Anzahl funktioneller Gruppen erhebliche Nachteile dar. Im Rahmen dieser Arbeit wurden verschiedene Synthesestrategien entwickelt, die eine gezielte, pH-gesteuerte Spaltbarkeit von PEG, PEG-basierten Lipiden und Tensiden ermöglichen. Große Aufmerksamkeit galt dabei der Untersuchung der Hydrolysekinetiken der neuartigen Materialien, um deren Potential im Hinblick auf zukünftige Anwendungsgebiete zu evaluieren. In einem weiteren Projektabschnitt wurden hyperverzweigte Polyglycerin-Strukturen synthetisiert, die wegen ihrer Vielzahl an funktionellen Hydroxylgruppen als vielversprechende Alternativen zu PEG diskutiert werden. Kapitel 1.1 gibt eine kurze Einführung zur Chemie von PEG, in deren Verlauf unterschiedliche synthetische Ansätze zum Einbau funktioneller Gruppen in das Polyetherrückgrat bzw. an den Kettenenden vorgestellt werden. Ein besonderes Augenmerk liegt hierbei auf der anionischen Ring-Öffnungspolymerisation (AROP), welche die grundlegende Polymerisationstechnik dieser Arbeit darstellt. Kapitel 1.2 bietet eine Übersicht zu Liposomen als Wirkstofftransportsysteme und präsentiert aktuelle Entwicklungen in den Bereichen sterisch stabilisierte Liposomen („Stealth Liposomen“), aktives Targeting und stimuli-gesteuerte Wirkstofffreisetzung. Insbesondere die Vorteile von pH-spaltbaren PEG-Lipiden in liposomalen Formulierungen werden in diesem Kapitel diskutiert. Blockcopolymer-Strukturen auf Basis von Polypropylenoxid (PPO) und PEG (bzw. PEO), mit einem Schwerpunkt auf PEO-b-PPO-b-PEO Copolymeren (Poloxameren), werden in Kapitel 1.3 vorgestellt sowie deren breites Anwendungsspektrum als Tenside. Zudem werden aktuelle Trends im Bereich nicht-ionischer, PEO-/PPO-basierter Tenside erörtert. Die Nachteile der Nicht-Abbaubarkeit von PEG im Hinblick auf Molekulargewichtsbeschränkungen für den Einsatz in der Biomedizin stehen im Fokus der Betrachtung in Kapitel 1.4, wobei vor allem aktuelle Entwicklungen auf dem Gebiet der spaltbaren PEGs zusammengefasst werden. Kapitel 1.3 und 1.4 sind Auszüge aus einem umfassenden Übersichtsartikel, der in der englischsprachigen Zeitschrift Chemical Reviews publiziert wurde. Kapitel 2 beschäftigt sich mit der Herstellung von Acetal-funktionellen, amphiphilen PEO-b-PPO-b-PEO Copolymeren und deren Einsatz als pH-spaltbare Tenside (Surfactants) in Miniemulsionspolymerisationen (MEPs). Die säurespaltbaren Poloxamer-Analoga wurden in einem Proof-of-Concept Experiment zur Herstellung von Polystyrol-Nanopartikeln mittels MEP verwendet. Durch eine pH-gesteuerte Spaltung der Polyether-Tenside konnte eine Präzipitation der Nanopartikel induziert werden, die eine effiziente Abtrennung der Additive ermöglicht, wodurch Tensid-freie Nanopartikel erhalten wurden. Diese sind zum einen aus umwelttechnischen Gesichtspunkten von Bedeutung, zum anderen können enthaltene Tenside eine Beeinträchtigung der Partikeleigenschaften bewirken. Die Abtrennung von nicht-spaltbaren Tensiden nach erfolgreicher MEP ist häufig mit großem Aufwand verbunden. Die Synthese pH-spaltbarer PEGs mit einer einstellbaren Anzahl an säurelabilen Vinylether-Gruppen im Polyetherrückgrat und einer definierten Hydroxyl-Endgruppe wird in Kapitel 3 behandelt. Durch die anionische ring-öffnende Copolymerisation von 3,4-Epoxy-1-butene (EPB) und Ethylenoxid mit anschließender katalytischer Isomerisierung der Allylether-Gruppen konnten engverteilte, pH-spaltbare P(EPB-co-EG) Copolymere mit niedrigen Anteilen an EPB (4 mol%) in einer zweistufigen Synthese hergestellt werden. Durch gelpermeationschromatographische Untersuchungen wurden moderate Molekulargewichtsverteilungen (Ð = 1.6 – 1.8) der Spaltprodukte ermittelt. Die Untersuchung der Hydrolysekinetik der Copolymere durch in situ 1H NMR Spektroskopie in einem physiologisch-relevanten pH-Bereich (4.4 – 5.4) zeigte vielversprechende Abbaukinetiken im Hinblick auf biomedizinische Anwendungen, z.B. für spaltbare, langzirkulierende Polymer-Wirkstoff-Konjugate. Kapitel 4 beschreibt die Synthese von pH-spaltbaren PEG-Lipiden mit säurelabilen Acetal- und Ketal-Gruppen und deren Einsatz in pH-responsiven „Stealth“-Liposomen. Eine neue Synthesestrategie zur Einführung asymmetrischer Ketale in Polymere wurde entwickelt, um PEG-Lipide mit einstellbaren Molekulargewichten und einer definierten Hydroxyl-Endgruppe zu generieren, wodurch weitere polymeranaloge Umsetzungen möglich sind. Mit Hilfe von in situ 1H NMR Spektroskopie konnte eine signifikant höhere Hydrolysegeschwindigkeit der Ketal-PEG-Lipide im Vergleich zu den Acetal-Derivaten nachgewiesen werden. Die Abspaltungskinetik der PEG-Ketten von der Liposomen-Membran konnte durch speziell entwickelte zeitabhängige, fluoreszenzspektroskopische und gelelektrophoretische Experimente analysiert werden. Die mit Ketal-PEG-Lipiden modifizierten Liposomen zeigten schnelle Abspaltungskinetiken der PEG-Korona im schwach sauren Milieu (pH = 5.5 – 6.5), was die neuartigen Lipide zu einer vielversprechenden Strukturklasse für Liposomen-basierte, pH-gesteuerte Wirkstofffreisetzungsstrategien insbesondere für die Tumortherapie macht. Kapitel 5 stellt einen Vergleich zwischen monofunktionellen, linearen PEG-Lipiden und multifunktionellen, hyperverzweigten Polyglycerin (hbPG)-Lipiden hinsichtlich deren Eigenschaften in liposomalen Formulierungen vor. HbPG-Lipide mit Molekulargewichten von 3 bis 7 kg mol-1 wurden unter Verwendung eines neuartigen, Dialkyl-basierten linPG-Lipids als Makroinitiator für die hyperverzweigende, anionische Ringöffnungspolymerisation von Glycidol durch langsame Monomerzugabe hergestellt. Zudem konnten Dialky-PEG-Lipide mit vergleichbaren Molekulargewichten durch AROP von Ethylenoxid synthetisiert werden. hbPG-/PEG-Lipide wurden mittels dualer Zentrifugation in Liposomen formuliert, wobei eine Kontrolle der Liposomendurchmesser unterhalb von 100 nm erzielt werden konnte. Dies wurde als optimale Größe für nanoskopische Trägersysteme in der Antitumortherapie beschrieben. Daraus konnten erste in vivo Biodistributionsstudien mit 18F-markierten Lipiden unter Verwendung von Positronen-Emissions-Tomographie (PET) die erwünschte, schnelle renale Ausscheidung der reinen linearen/hyperverzweigten Lipide bestätigen. Für radiomarkierte, Polyether-modifizierte Liposomen wurden Blutzirkulationzeiten von mehr als 1h beobachtet, wodurch erstmals „Stealth“-Eigenschaften hbPG-modifizierter Liposomen in vivo nachgewiesen werden konnten.
DDC:	540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-7585
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-fe916f0a-71b3-4a48-a9ab-12c4db19ed0b1
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	CC BY-ND
Information on rights of use:	https://creativecommons.org/licenses/by-nd/4.0/
Extent:	244 Seiten, Illustrationen, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen