Authors:	Dominelli, Nazzareno
Title:	Adaptation and regulation of the alternative lifestyle of insect pathogenic Photorhabdus luminescens in the soil and its potential as biocontrol agent
Online publication date:	11-Jul-2022
Year of first publication:	2022
Language:	english
Abstract:	Soil living and plant beneficial bacteria rose in importance as biocontrol agents in sustainable agriculture as many pests and diseases harshly reduce crop yields. Photorhabdus luminescens is a Gram-negative bacterium living in symbiosis with entomopathogenic nematodes (EPNs) and is highly pathogenic towards a wide range of insect larvae. The EPNs-Photorhabdus complex is already employed in agriculture as biocontrol agent. P. luminescens exists in two phenotypically different forms, the primary (1°) and the secondary (2°) cell variants, however only the 1° cells live in mutualistic symbiosis with EPNs. Once the nematodes invade insects and release P. luminescens into the hemocoel, the bacteria effectively kill the larvae. During the infective lifecycle up to 50% of 1° cells switch to the 2° phenotype. Since 2° cells cannot reassociate with EPNs they are left in soil when the insect cadaver is depleted. Both cell variants are believed to share identical genomes, but they differ in many phenotypic traits, which is referred to as phenotypic heterogeneity. However, the fate of 2° cells in the soil and therefore the biological reason for phenotypic heterogeneity is unclear. Moreover, the genetical identity of both cell variants has not been confirmed yet. For that purpose, this work focuses on the biological role of 2° cells in the rhizosphere. First, to understand the regulation processes that are involved in phenotypic switching and to obtain a first idea for the fate of 2° cells a comparative transcriptome analysis of P. luminescens DJC 1° cells and 2° cells was performed. First of all, it could be proved that the different 1° and 2° specific phenotypes are regulated at transcriptional level. In fact, the respective genes coding for 1°-specific features like e.g., pigmentation, bioluminescence, clumping factors were downregulated in 2° cells. Furthermore, differently expressed genes (DEGs) coding for different LuxR solos were identified, indicating that a yet unknown circuit of cell-cell communication could exist in 2° cells. For example, the major regulator of quorum sensing (QS) in 1° cells, pluR, was downregulated in 2° cells, whereas genes encoding PAS4-LuxR-solos PluDJC_10415-PluDJC_10460 and two LuxR-solos with an undefined signal binding domain PluDJC_09555 and PluDJC_21150 were upregulated in 2° cells. This also points out a putative regulatory role of QS in P. luminescens phenotypic heterogeneity. Furthermore, DEGs involved in stress-response such as starvation related genes were upregulated, while genes involved in metabolism were differently modulated in 2° cells XIV indicating an adaptation to the nutrient-limited availability in the soil. Moreover, increased swimming and twitching motility as well as chemotaxis, which are essential for rhizosphere colonization, were observed for 2° cells. This supports the hypothesis of an alternative lifecycle of P. luminescens in the rhizosphere. Remarkably, 2° cells chemotactically responded to plant root exudates (PRE), showed increased biofilm formation, and specifically interacted with plant roots. Additionally, plant growth promoting ability of this cell variant could be determined. To further understand the adaptability of 2° cells to plant roots, a comparative transcriptome analysis was performed comparing 2° cells supplemented with and without PRE. Here, DEGs involved in e.g., biofilm formation, motility, or chitin degradation were identified to be upregulated in the presence of PRE. Two of the most upregulated genes were those encoding a putative chitin binding protein and a putative chitinase (Chi2A) suggesting the chitin degrading and therefore fungicidal activity of 2° cells in the soil. Indeed, 2° cells specifically inhibited growth of phytopathogenic Fusarium graminearum after physical contact. This ability was impaired in P. luminescens 2° Δchi2A and Δcbp deletion mutants. Furthermore, in planta assays using tomato plants infected with F. graminearum proved that 2° cells could protect the plant from infection and therefore promoted plant growth, which was not the case using P. luminescens 1° wildtype and the 2° Δchi2A and Δcbp deletion mutants. Moreover, effective chitin degradation was verified using purified Chi2A enzyme. This indicates a role of 2° cells in protecting plants from phytopathogens upon root colonization. Moreover, a SdiA-like LuxR solo was identified as an essential player in interkingdom signaling (IKS) communication between plants and the bacteria. SdiA could play a role in the first steps of root colonization as a decreased motility and increased biofilm formation of P. luminescens 2° ΔsidA was observed compared to wildtype 2° cells. A plant-derived signaling molecule is assumed to be sensed by SdiA, which could lead to expression of genes important for the 2° cells-plant interaction. Furthermore, putative binding of long and short chain N-acyl homoserine lactones (AHLs) to SdiA were suggested, as different folding conformations occurred upon binding. Using surface plasmon resonance spectroscopy a direct and high affine interaction of purified SdiA to its own promoter as well as to the promoter of the gene adjacent to sdiA, aidA, could be demonstrated. This indicated a bidirectional transcriptional regulation of the intergenic aidA-sdiA promoter region. Furthermore, a putative role of AidA in microbe-host interaction and an accurate self-regulatory mechanism of SdiA could be assigned. Summary XV Lastly, to verify phenotypic heterogeneity in P. luminescens subs. laumondii DJC strain high-throughput sequencing data of the respective genomes were analyzed. With that the genetic similarity of both cell variants should be confirmed to exclude genotypic heterogeneity. Indeed, it could be confirmed that P. luminescens DJC 1° and 2° are genetical identical, and that large genome rearrangements are not involved in the switch from the 1° to the 2° phenotype. In conclusion, the presented thesis gives direct evidence for an alternative lifestyle of P. luminescens 2° in the rhizosphere for the first time. The bacteria show a specific adaptation to plant roots protecting them from phytopathogenic fungi. Besides the biotechnological use of P. luminescens 1° cells as bioinsecticides, 2° cells could be used as plant growth promoting organism and as biopesticide for plant protection in the future. Pflanzennützliche Bodenbakterien gewinnen als Biofungizide und Bioinsektizide in der nachhaltigen Landwirtschaft zunehmend an Bedeutung, da viele Schädlinge und Krankheiten die Ernteerträge stark beeinträchtigen. Photorhabdus luminescens ist ein Gram-negatives Bakterium, das in Symbiose mit entomopathogenen Nematoden (EPN) lebt und für eine Vielzahl von Insektenlarven hoch pathogen ist. Der EPN-Photorhabdus-Komplex wird bereits in der Landwirtschaft als Bioinsektizid eingesetzt. P. luminescens existiert in zwei phänotypisch unterschiedlichen Formen, der primären (1°) und der sekundären (2°) Zellvariante, wobei nur die 1°-Zellen in Symbiose mit den EPN leben. Sobald die Nematoden in die Insekten eindringen und P. luminescens in das Hemocoel freisetzen, werden die Larven durch die Bakterien schnell und effizient abgetötet. Im Lebenszyklus wechseln während der Infektion bis zu 50 % der 1°-Zellen zum 2°-Phänotyp. Da 2°-Zellen nicht mit den EPN reassoziieren können, verbleiben sie im Boden, wenn die Nährstoffe im Insektenkadaver aufgebraucht sind. Es wird angenommen, dass beide phänotypisch unterschiedlichen Zellvarianten genetisch identisch sind, was als phänotypische Heterogenität bezeichnet wird. Über den Verbleib der 2°-Zellen im Boden und damit der biologische Hintergrund für die phänotypische Heterogenität ist nichts genaues bekannt. Außerdem ist die genetische Identität der beiden Zellvarianten noch nicht bestätigt worden. Aus diesem Grund fokussiert sich diese Arbeit auf die biologische Rolle der 2°-Zellen in der Rhizosphäre. Um die Regulationsprozesse zu verstehen, die an dem phänotypischen Phasenwechsel beteiligt sind, und um Hinweise über das Schicksal der 2°-Zellen zu erhalten, wurde zunächst eine vergleichende Transkriptomanalyse von P. luminescens DJC 1°-Zellen und 2°-Zellen durchgeführt. Zunächst konnte nachgewiesen werden, dass die unterschiedlichen 1°- und 2°-spezifischen Phänotypen tatsächlich auf transkriptioneller Ebene reguliert werden. Die Expression der entsprechenden Gene, die für 1°-spezifische Merkmale wie z. B. Pigmentierung, Biolumineszenz und Verklumpungsfaktoren kodieren, war in 2°-Zellen herunterreguliert. Darüber hinaus wurden unterschiedlich exprimierte Gene (DEGs) identifiziert, die für LuxR-Solos kodieren. Dies deutet darauf hin, dass in 2°-Zellen eine noch unbekannte Art der Zell-Zell-Kommunikation existieren könnte. So wurde beispielsweise die Expression des wichtigsten Regulator-Gens des Quorum Sensing (QS) in 1°-Zellen, pluR, in 2°-Zellen Zusammenfassung XVII herunterreguliert. Hingegen war die Expression der Gene, die für die PAS4-LuxR-Solos PluDJC_10415-PluDJC_10460 und zwei LuxR-Solos mit einer nicht definierten Signalbindungsdomäne PluDJC_09555 und PluDJC_21150 kodieren, in 2°-Zellen hochreguliert. Dies weist ebenfalls auf eine mutmaßliche regulatorische Rolle von QS bei der phänotypischen Heterogenität von P. luminescens hin. Darüber hinaus wurden DEGs, die bei der Stressantwort beteiligt sind, identifiziert. Darunter waren Gene, die mit Nährstoffmangel und dem Primärstoffwechsel in Verbindung stehen, in der Expression hoch- bzw. herunterreguliert, was auf eine Anpassung der Bakterien an die begrenzte Nährstoffverfügbarkeit im Boden hindeutet. Darüber hinaus wurden bei 2°-Zellen eine erhöhte Schwimm- und Zuckungsmotilität sowie Chemotaxis beobachtet, die für die Besiedlung der Rhizosphäre von essenzieller Bedeutung sind. Dies unterstützt die Hypothese eines bisher nicht bekannten Lebenszyklus von P. luminescens in der Rhizosphäre. Weiterhin reagierten die 2°-Zellen chemotaktisch auf Pflanzenwurzelexsudate (PRE), zeigten eine verstärkte Biofilmbildung und interagierten spezifisch mit Pflanzenwurzeln. Darüber hinaus konnte die Fähigkeit dieser Zellvariante zur Förderung des Pflanzenwachstums beobachtet werden. Um die Anpassungsfähigkeit von 2°-Zellen an Pflanzenwurzeln besser zu verstehen, wurde eine vergleichende Transkriptomanalyse durchgeführt, bei der 2°-Zellen mit und ohne PRE verglichen wurden. Dabei wurde festgestellt, dass die Expression von Genen, die z. B. an der Biofilmbildung, der Motilität oder dem Abbau von Chitin beteiligt sind, in Gegenwart von PRE hochreguliert waren. Zwei der am stärksten in der Expression induzierten Gene waren diejenigen, die für ein potenzielles Chitin-bindendes Protein (CBP) und eine potenzielle Chitinase (Chi2A) kodieren, was auf eine chitinolytische und damit fungizide Aktivität der 2°-Zellen im Boden schließen lässt. Tatsächlich hemmten 2°-Zellen nach physischem Kontakt spezifisch das Wachstum von phytopathogenen Fusarium graminearum. In planta Tests mit F. graminearum infizierten Tomatenpflanzen zeigten außerdem, dass 2°-Zellen die Pflanze vor einer Infektion mit dem Pilz schützen konnten und somit das Pflanzenwachstum förderten. Diese Fähigkeit war bei P. luminescens 2° Δchi2A- und Δcbp-Deletionsmutanten beeinträchtigt. Eine chitinolytische Aktivität von Chi2A wurde mit gereinigtem Enzym bestätigt. Insgesamt deuteten diese Experimente auf eine wichtige Rolle der 2°-Zellen beim Schutz der Pflanzen vor Phytopathogenen bei der Wurzelbesiedlung hin. XVIII In einem weiteren Teil der Arbeit wurde das Interkingdom-Signaling (IKS) zwischen P. luminescens und der Pflanze untersucht. Dazu wurde ein SdiA-ähnlicher LuxR-Solo als wesentlicher Rezeptor im IKS zwischen Pflanzen und den Bakterien identifiziert. SdiA könnte eine Rolle bei den ersten Schritten der Wurzelbesiedlung spielen, da eine verringerte Motilität und eine erhöhte Biofilmbildung von P. luminescens 2° ΔsidA im Vergleich zu Wildtyp 2°-Zellen beobachtet wurde. Es wird angenommen, dass ein von der Pflanze stammendes Signalmolekül von SdiA wahrgenommen wird, was zur Expression von Genen führen könnte, die für die Interaktion zwischen 2°-Zellen und Pflanze wichtig sind. Darüber hinaus wurde eine mögliche Bindung von lang- und kurzkettigen N-Acylhomoserinlaktonen (AHLs) an SdiA vermutet, da bei der Bindung dieser Moleküle unterschiedliche Thermostabilitäten des Proteins beobachtet wurden. Mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie konnte eine direkte und hochaffine Wechselwirkung von gereinigtem SdiA mit seinem eigenen Promotor sowie mit dem Promotor des Nachbargens von sdiA, aidA, nachgewiesen werden. Dies deutete auf eine bidirektionale Transkriptionsregulation der intergenen aidA-sdiA-Promotorregion hin. Darüber hinaus konnte eine mutmaßliche Beteiligung von AidA bei der Interaktion zwischen Bakterium und dem Pflanzenwirt sowie ein genauer Selbstregulierungsmechanismus von SdiA nachgewiesen werden. Zuletzt wurden zur Überprüfung der phänotypischen Heterogenität in P. luminescens subsp. laumondii DJC-Stamm Hochdurchsatz-Sequenzierungsdaten der jeweiligen Genome analysiert. Damit sollte die genetische Ähnlichkeit beider Zellvarianten bestätigen werden, um genotypische Heterogenität auszuschließen. In der Tat konnte bewiesen werden, dass P. luminescens DJC 1° und 2° genetisch identisch sind und dass große Genom-Umlagerungen nicht am phänotypischen Phasenwechsel vom 1°- zum 2°-Phänotyp beteiligt sind. Zusammenfassend zeigt die vorliegende Arbeit zum ersten Mal einen direkten Beweis für eine neue Lebensweise von P. luminescens 2° in der Rhizosphäre. Die Bakterien besiedeln spezifisch Pflanzenwurzeln im Boden und schützen ihren neuen Wirt vor einer Infektion mit phytopathogenen Pilzen. Neben der biotechnologischen Nutzung von P. luminescens 1°-Zellen als Bioinsektizid könnten 2°-Zellen daher in Zukunft als effiziente pflanzenwachstumsfördernde Mikroorganismen sowie als Biopestizide im Pflanzenschutz eingesetzt werden.
DDC:	570 Biowissenschaften 570 Life sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 10 Biologie
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-7256
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-38243091-d90a-480c-9d89-ad3b5557b9f58
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	CC BY-SA
Information on rights of use:	https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/
Extent:	XVIII, 185 Seiten, Illustrationen, Diagramme
Appears in collections:	JGU-Publikationen