Authors:	Grus, Tilmann
Title:	PSMA inhibitor-based radiopharmaceuticals for diagnosis and therapy of prostate cancer
Online publication date:	12-Jul-2022
Year of first publication:	2022
Language:	english
Abstract:	Prostate cancer (PCa) is the second most common diagnosed cancer type among men worldwide. In relation to death rate, it is on the fifth place of all cancer types worldwide. When it is diagnosed early, the chances of cure are very good with a 5-year survival rate of 98%. Patients with advanced cancer often develop metastases, reducing the chances of cure drastically. Thus, an early diagnosis and therapy is crucial for an appropriate medical care. The prostate-specific membrane antigen (PSMA) is a membrane-bound glycoprotein, which shows only a low expression in the healthy prostate but can be overexpressed up to 1000-fold by prostate cancer cells. Additionally, the expression correlates with the progress of the disease enabling classification of the stage of the disease. The discovery and exploration of PSMA led to an improvement of the patients care. Today, PSMA is used as target structure for the targeted diagnosis and therapy of prostate cancer and related metastases. PSMA gained particular interest in the field of radiopharmacy. Here, addressing PSMA enables an early imaging and diagnosis of prostate cancer in the positron emission tomography (PET) or single-photon emission computed tomography (SPECT), even before morphological chances can be seen in computed tomography (CT) or magnetic resonance imaging (MRI). Besides this, PSMA enables the targeted enrichment of therapeutic radiopharmaceuticals. Many sensitive and highly potent PSMA radiopharmaceuticals were developed in the last years. Especially known among these are [68Ga]Ga PSMA-11 for PET, which is already approved by the FDA and [177Lu]Lu-PSMA-617 for therapy of PCa. Despite the research already conducted and the clinically established radiopharmaceuticals, in PSMA-based diagnosis and therapy of PCa there are still fields and problems that need to be improved or solved. Examples are the unwanted off-target accumulation of PSMA ligands or the targeted drug delivery. The aim of this work is the development of novel PSMA ligands, improvement of already existing ligands and the provision of solutions and applications for the existing problems of the PSMA imaging and therapy. For this purpose, new designed radiopharmaceutical compounds were synthesized, radiolabelled with diagnostic and/or therapeutic radionuclides, evaluated regarding their in vitro properties and in part evaluated regarding in vivo behaviour. The first section of this work sets its focus on the use of the hybrid chelators DATA5m and AAZTA5 as radiolabelling moiety. Here, different PSMA inhibitors were functionalised with the hybrid chelators. The DATA5m-based compounds DATA5m.SA.KuE and DATA5m.PSMA-617 were evaluated regarding their radiolabelling properties with gallium-68. In followed up in vitro binding affinity studies the PSMA binding behaviour of the two compounds were examined. AAZTA5.SA.KuE, which was synthesised and evaluated radiochemically in previous studies, was also included. In animal studies, the potential of [68Ga]Ga-DATA5m.SA.KuE as diagnostic radiopharmaceutical and [44Sc]Sc-/[177Lu]Lu-AAZTA5.SA.KuE as theranostic PSMA ligand were proven, as they show better kidney clearance than [68Ga]Ga PSMA 11, for example. The second part deals with the problem of the PSMA-based therapy of PCa related bone metastases, since PSMA expression in bone metastases can be very heterogeneous. This makes the therapy with normal PSMA ligands more difficult. To solve this problem, the compound DOTA L Lys(SA.Pam) PSMA 617 was developed in this work. Beside a PSMA target vector, the compound contains an additional bisphosphonate structure as targeting unit. The bisphosphonate enables the enrichment in bone areas with increased metabolism, as it is found in bone metastases. This enables the enrichment in PCa related bone metastases via two independent mechanisms. After synthesis, the novel compound was successfully radiolabelled with the therapeutic nuclide lutetium 177 and it showed a high in vitro PSMA and bone binding potential. In in vivo studies with tumour-bearing mice, it showed promising enrichment in the tumour as well as in the bone. This makes [177Lu]Lu-DOTA-L-Lys(SA.Pam)-PSMA-617 to an interesting compound for therapy of PCa related bone metastases. In the third part of this work, two drug delivery systems were developed, which enable the targeted transport of drugs to the prostate cancer cells via a PSMA targeting unit. For this purpose, BisHD-hbPG polymers were functionalised with a SA.KuE target vector and formed into liposomes. An additional 18F-label enables the evaluation of the in vivo behaviour of the PSMA liposomes in PET measurements. In this work, the functionalisation of the polymers with the PSMA inhibitor, the radiolabelling and the liposome formation were established successfully. The in vivo examinations are pending. As second delivery system, a small molecule drug delivery conjugate (SMDC) was synthesized and evaluated. The cytotoxic drug MMAE was conjugated via the enzymatically cleavable linker valine-citrulline and squaric acid to the PSMA targeting unit 617.KuE. In vitro examinations showed that the novel compound is able to transport the drug via PSMA targeting to the cancer cell and MMAE is released via degradation of the valine-citrulline linker. Nevertheless, the cytotoxicity of the compound is lower than the cytotoxicity of free MMAE and the PSMA affinity is not that good than that of PSMA-617. Animal studies displayed that the application of the novel compound can inhibit tumour growth. Here, optimisation of the structure is necessary to increase affinity and cytotoxicity. The last part of this work deals with the optimisation of the lysine-urea-glutamate (KuE) structure, which is the targeting vector of the most common PSMA radiopharmaceuticals. It is literature-known that the structure lysine-glutamate-urea-glutamate (K-EuE) provides better pharmacological properties. Thus, both target vectors were conjugated to squaric acid and were evaluated regarding in vivo binding to PSMA along with the targeting unit of PSMA-617, KuE.617. All three structures had comparable affinities. Additionally, the influence of chelators on binding affinity should be examined. For this, each targeting unit was conjugated to the chelators DATA5m, AAZTA5 and DO2AGA and the PSMA affinity as determined. Here, it was particularly noticeable that the addition of a chelator led to a general degrease of affinity. This was especially evident with the targeting unit SA.K-EuE. It was shown that the SA.K-EuE targeting unit is not suitable for conjugation with chelators. The superiority of K-EuE over KuE as it is described in literature could not be confirmed for squaric acid-based compounds. Although the affinities of the chelator conjugated SA.KuE and 617.KuE got also lower but only to a lesser extent. Additionally, no clear trend could be observed which chelator or which targeting unit had the better affinity. This seems to be dependent of the respective combination. In further studies, spacer moieties should be introduced between chelator and targeting unit to evaluate if a further distance between the two units can reduce the affinity degreasing influence of the chelator. Prostatakrebs (PCa) ist die zweithäufigste diagnostizierte Krebsart unter Männern weltweit. Bezogen auf die Sterblichkeitsrate liegt Prostatakrebs auf Platz fünf aller weltweit vorkommenden Krebsarten. Bei frühzeitiger Diagnose sind die Heilungschancen mit einer 5-jahres-Überlebensrate von 98 % sehr gut. Patienten mit fortgeschrittenen Prostatakrebs entwickeln häufig Metastasen und die Heilungschancen sinken drastisch. Aus diesem Grund ist eine frühzeitige Diagnose und Therapie essentiell. Das Prostataspezifische Antigen (PSMA) ist ein membrangebundenes Glykoprotein, dass in der gesunden Prostata nur in einem sehr geringen Maße auftritt, aber von Prostatakrebszellen bis zu 1000 fach überexprimiert sein kann. Ebenso korreliert die Expression mit dem Verlauf der Krankheit, was eine Einschätzung des Krankeitsstadiums erlaubt. Die Entdeckung und Erforschung dieses membrangebundenen Proteins führte zu einer deutlichen Verbesserung der Patientenversorgung. So wird das PSMA heute als Targetstruktur zur zielgerichteten Diagnose und Therapie von Prostatakrebs und den entsprechenden Metastasen eingesetzt. Besonderes Interesse erlangte PSMA im Bereich der Radiopharmazie. Hier ermöglicht die Adressierung von PSMA die frühzeitige Bildgebung und Diagnose von Prostatakrebs in der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) oder Einzelphotonen-Emissionscomputertomographie (SPECT), noch bevor morphologische Veränderungen in der Computertomographie (CT) oder Magnetresonanztomographie (MRT) sichtbar werden. Daneben ermöglicht PSMA die zielgerichtete Anreicherung von therapeutischen Radiopharmaka. Viele sensitive und hoch potente PSMA Radiopharmaka wurden in den letzten Jahren entwickelt. Besonders bekannt sind hierunter das durch die FDA zugelassene [68Ga]Ga-PSMA-11 für die PET und [177Lu]Lu-PSMA-617 für die Therapie von PCa. Trotz der bereits erfolgten Forschung und bereits klinisch etablierten Radiopharmaka, gibt es immer noch Bereiche und Probleme in der Diagnose und Therapie von PCa mit Hilfe von PSMA, die es zu optimieren, beziehungsweise zu lösen gilt. Hier ist zum Beispiel die ungewollte off-target Anreicherung von PSMA Liganden oder auch der gezielte Wirkstofftransport zu nennen. Das Ziel dieser Arbeit ist die Entwicklung neuer PSMA Liganden, Verbesserung bereits existierender PSMA Liganden und die Bereitstellung von Lösungsansätzen und Anwendungen für bestehende Probleme der PSMA Bildgebung und Therapie. Dazu werden neu designte radiopharmazeutische Verbindungen synthetisiert, mit diagnostischen und/oder therapeutischen Radionukliden radioaktiv markiert und diese hinsichtlich ihrer in vitro Eigenschaften und zum Teil auch hinsichtlich ihrer in vivo Eigenschaften untersucht. Der erste Abschnitt dieser Arbeit legt seinen Fokus auf die Verwendung der Hybridchelatoren DATA5m und AAZTA5 als Radiomarkierungseinheit. Hierbei wurden verschiedene PSMA-Inhibitoren mit den Hybridchelatoren funktionalisiert. Die DATA5m basierten Verbindungen DATA5m.SA.KuE und DATA5m.PSMA-617 wurden hierbei hinsichtlich ihrer Radiomarkierungseigenschaften mit Gallium-68 untersucht. In folgenden in vitro Bindungsaffinitätsstudien wurden die beiden Verbindungen und die schon in voran gegangenen Arbeiten synthetisierte und radiochemisch untersuchte Verbindung AAZTA5.SA.KuE hinsichtlich hier PSMA Bindungseigenschaften untersucht. In Tierstudien konnte das Potential von [68Ga]Ga-DATA5m.SA.KuE als diagnostisches Radiopharmakon und [44Sc]Sc-/[177Lu]Lu-AAZTA5.SA.KuE als theranostischer PSMA-Ligand gezeigt werden, die zum Beispiel bessere Nierenausscheidung aufwiesen, als [68Ga]Ga PSMA 11. Der zweite Abschnitt befasst sich mit der Problematik der PSMA-basierten Therapie von PCa-bedingten Knochenmetastasen, da diese in ihrer PSMA Expression sehr heterogen sein können. Dies erschwert die Therapie mit reinen PSMA-Liganden. Zur Lösung dieses Problems, wurde in dieser Arbeit die Verbindung DOTA-L-Lys(SA.Pam)-PSMA-617 hergestellt. Sie besitzt neben einem PSMA Targetvektor auch eine Bisphosphonatstruktur als Targetvektor. Die Bisphosphonateineit ermöglicht die Anreicherung Knochenbereichen mit erhöhtem Stoffwechsel, wie er in Knochenmetastasen zu finden ist. So kann eine Anreicherung über zwei unterschiedliche Mechanismen erfolgen. Die entwickelte Verbindung wurde nach Synthese erfolgreich radiochemisch mit dem therapeutischn Nuklid Lutetium 177 markiert und zeigte in vitro hohes PSMA- und Knochenbindungspotential. In vivo Studien in tumortragenden Mäusen zeigten sowohl eine vielversprechende Anreicherung im Tumor, als auch im Knochenbereich, was [177Lu]Lu-DOTA-L-Lys(SA.Pam)-PSMA-617 zu einer Interessanten Verbindung für die Therapie von PCa-bedingten Knochenmetastasen macht. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden zwei Wirkstofftransportsysteme entwickelt, die es ermöglichen über einen PSMA-Targetvektor Wirkstoffe gezielt zur Prostatakrebszelle zu transportieren. Dazu wurden BisHD-hbPG-Polymere mit dem SA.KuE-Targetvektor funktionalisiert und zu Liposomen verarbeitet. Ein zusätzliches 18F-Label ermöglicht die Untersuchung des in vivo Verhaltens der PSMA-Liposome in PET Messungen. In dieser Arbeit konnte die Funktionalisierung der Polymere mit dem PSMA Inhibitor, die Radiomarkierung und die Liposomsynthese erfolgreich etabliert werden. Die in vivo Untersuchungen stehen noch aus. Als zweites Wirkstofftransportsystem wurde ein Small molecule drug delivery Konjugat (SMDC) synthetisiert und evaluiert. Dazu wurde das Zytostatikum MMAE über den enzymatisch spaltbaren Linker Valin-Citrullin und über Quadratsäure an den PSMA-Targetvektor 617.KuE gekoppelt. In vitro Untersuchungen zeigten, dass die neue Verbindung gezielt über PSMA transportiert wird und auch die MMAE Freisetzung gezielt über den Valin-Citrullin-Linker erfolgt, allerdings ist die Zytotoxizität geringer, als die des freien MMAEs und auch die PSMA-Affinität ist deutlich schlechter, als die von PSMA-617. Tierstudien zeigten, dass die Applikation der Verbindung das Tumorwachstum inhibieren kann. Hier ist eine Optimierung der Struktur nötig zur Erhöhung der Affinität und Zytotoxizität. Der vierte Abschnitt behandelt die Optimierung der Lysin-Harnstoff-Glutamat (KuE) Struktur, die als Targetvektor in den gängigsten PSMA-Radiopharmaka vorkommt. Es ist Literaturbekannt, dass die Struktur Lysin-Glutamat-Harnstoff-Glutamat (K-EuE) bessere pharmakologische Eigenschaften aufweist. Daher wurden beide Targetvektoren an Quadratsäure gekoppelt und zusammen mit der Targetingeinheit von PSMA-617, 617.KuE hinsichtlich der in vitro Bindung an PSMA untersucht. Alle drei Strukturen wiesen ähnliche Affinitäten auf. Des Weiteren sollte der Einfluss von Chelatoren auf die Bindungsaffinität untersucht werden. Dazu wurde an jede der drei Targetingeinheiten die Chelatoren DATA5m, AAZTA5 und DO2AGA gekoppelt und ebenfalls die PSMA-Affinität bestimmt. Hier viel besonders auf, dass sich durch die Anbringung eines Chelators generell die Affinität verschlechtert. Dies war besonders deutlich bei SA.K-EuE. Es wurde gezeigt, dass der SA.K-EuE Targetvektor nicht geeignet ist für die Konjugation an Chelatoren. Die, in der Literatur benannte, Überlegenheit von K EuE gegenüber KuE konnte für Quadratsäure-basierte Verbindungen nicht bestätigt werden. Zwar verschlechterten sich die Affinitäten auch beim Anbringen eines Chelators an SA.KuE und 617.KuE, allerdings nur in einem geringen Maße. Hier war außerdem kein eindeutiger Trend zu erkennen, welcher Chelator oder welche Targeteinheit die besten Affinitäten ermöglicht. Dies scheint abhängig von der jeweiligen Kombination zu sein. In weiteren Studien sollte ein Spacer zwischen Chelator und Targetingeinheit gebracht werden, um zu untersuchen, ob so der Einfluss des Chelators auf die Affinität reduziert werden kann.
DDC:	500 Naturwissenschaften 500 Natural sciences and mathematics 540 Chemie 540 Chemistry and allied sciences
Institution:	Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department:	FB 09 Chemie, Pharmazie u. Geowissensch.
Place:	Mainz
ROR:	https://ror.org/023b0x485
DOI:	http://doi.org/10.25358/openscience-6937
URN:	urn:nbn:de:hebis:77-openscience-032d49ad-e188-44a4-848e-db0f65afd6bf3
Version:	Original work
Publication type:	Dissertation
License:	CC BY
Information on rights of use:	https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Extent:	273 Seiten, Illustrationen
Appears in collections:	JGU-Publikationen