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Authors: Brückner, Maximilian Bernhard
Advisor: Mailänder, Volker
Title: Functionalization of nanocarriers with antibodies and their ability of targeting dendritic cells in vitro and in vivo
Online publication date: 23-Jun-2022
Language: german
Abstract: Antikörper-funktionalisierte Nanoträger, die als Transportmittel eingesetzt werden, haben das Potenzial, die Leistung der Krebsimmuntherapie deutlich zu verbessern in dem sie immunmodulatorische Wirkstoffe an dendritische Zellen adressieren. Dennoch verhindern Missverständnisse in den Bereichen der Nano-Bio-Grenzfläche, der kontrollierten Biokonjugation von Bindeproteinen auf der Nanoträgeroberfläche und der selektiven Wirkstoffabgabe an dendritische Zellen eine erfolgreiche Umsetzung von antikörperfunktionalisierten Nanoträgern für eine direkte Anwendung und kommerziellen Nutzen. Daher wurde in dieser Arbeit zunächst die Nano-Bio-Grenzfläche verschiedener Nanoträgersysteme untersucht, die in menschlichem Blutplasma und Serum inkubiert wurden, um den Einfluss der Waschmedien auf die Zusammensetzung der biomolekularen Korona zu ermitteln. Mit Hilfe der Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und der Flüssigchromatographie gekoppelt mit Massenspektrometrie (LC-MS) wurde gezeigt, dass die Waschmedien die adsorbierten Proteinzusammensetzungen veränderten und beim Waschen mit Wasser die Proteinstabilität beeinträchtigten, wie die Differential-Scanning-Fluorimetrie im Nanomaßstab (nanoDSF) zeigte. Darüber hinaus wurde beobachtet, dass unterschiedlich gewaschene Nanoträger, die mit Krebs- (HeLa) und Makrophagen-Zellen (RAW264.7) inkubiert wurden, ein abweichendes Aufnahmeverhalten zeigten. Die gewonnenen Erkenntnisse unterstreichen somit den Einfluss des Waschmediums für den Nachweis von Proteinzusammensetzungen und die gezielte Abstimmung der Proteinkorona zur Anreicherung bestimmter Proteine für eine gezielte Aufnahme des Nanoträgersystems. Der zweite Schwerpunkt dieser Arbeit lag auf der Herstellung von antikörperfunktionalisierten Nanoträgern, die in vitro an dendritische Zellen binden. Dendritische Zellen stellen ein vielversprechendes Ziel in der Immuntherapie dar, zum Beispiel zur Verbesserung der Wirksamkeit von Impfstoffen, da sie bestimmte Immunreaktionen steuern können. Aus diesem Grund zeigte die Bindung an CD11c-Rezeptoren auf dendritischen Zellen (DC2.4) wichtige Unterschiede zwischen konventionellen und weiterentwickelten Konjugationsstrategien. Demnach führte eine gezielte Modifizierung von Antikörpern an ihrer Glykosylierungsstelle zu einer ausgerichteten Nanoträgerimmobilisierung (Site-Click Chemie), während Lysin modifizierte Antikörper eine zufällige Oberflächenimmobilisierung (Thiol-Maleimid Chemie) aufwiesen. Diese Oberflächenmodifizierung beeinflusste die Bindung an dendritische Zellen, entweder spezifisch über die Fab Regionen des Antikörpers oder unspezifisch über die Fc Region, was anhand von Blockierungsexperimenten (Durchflusszytometrie) analysiert wurde. Darüber hinaus verhinderte die Vorinkubation in Mausplasma nicht die Bindungsfähigkeit der mit Site-Click erzeugten antikörperfunktionalisierten Nanoträger, was ihre große Zielgenauigkeit unter physiologischen Bedingungen unterstreicht. Mit Blick auf die physiologische Umgebung stellen Versuche an Mäusen ein wesentliches präklinisches Verfahren dar, um zu sehen, wie Patienten auf die Behandlung reagieren könnten. Daher wurde in der Folgestudie die dendritische populationsspezifische Zielwirksamkeit der antikörpermodifizierten Nanoträger in vivo untersucht. In der Mausstudie konnte gezeigt werden, dass CLEC9A antikörperfunktionalisierte Nanoträger ein robust dendritisch und populationsspezifisches Zielsystem darstellen, welches eine selektive Bindung an konventionelle dendritische Zellen vom Typ 1 (cDC1) und plasmazytoide dendritische Zellen ermöglicht. Diese dendritischen Zellen stellen wirksame Populationen in der Behandlung von Krebs wieder. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die Nachahmung der biomolekularen Korona in unserem ex vivo Ansatz die realistische in vivo Korona besser widerspiegelt als die üblicherweise verwendete in vitro Korona. Insgesamt haben die Experimente an Mäusen das große Potenzial unseres vielseitigen, mit Antikörpern funktionalisierten Nanoträgersystems für die Verbesserung der dendritischen zellbasierten Impfung in der Krebsimmuntherapie zusätzlich bestätigt. Weiterhin haben Untersuchungen zur Länge des Polyethylenglycol-Adapters gezeigt, dass ein gewisser Abstand zwischen dem Antikörper und der Nanoträgeroberfläche notwendig ist, um die Fab vermittelte Bindung von dendritischen Zellpopulationen mit geringerem Einfluss der Fc Region zu verbessern. Die Fc Region ganzer Antikörper verhindert jedoch das volle Potenzial ihrer präzisen Bindung, was zu einer möglichen Anhäufung in unerwünschten Körperregionen und einer Schädigung des Patienten führen kann. Deshalb wurde in unserem dritten und letzten Teil der Arbeit gezeigt, wie Rattenantikörper durch enzymatischen Pepsinverdau und milde Reduktion durch Cysteamin in verschiedene F(ab)2- und Fab'-Fragmente umgewandelt werden können. Dennoch steht die Reinigung von unerwünschten Resten und die Oberflächenfunktionalisierung auf dem Nanoträger und damit die Untersuchung der Bindungsfähigkeit noch aus. Experimente mit Nanobodies haben außerdem gezeigt, wie wichtig die für die Konjugation verwendeten Parameter sind, die die biologische Bindungsaktivität beeinflussen. Außerdem wurde gezeigt, dass die Menge an Nanobodies und damit die Oberflächenbedeckung, die für die Immobilisierung verwendet wird, in hohem Maße die Bindungswirksamkeit der Nanoträgerkonjugate in Primärzellen bestimmt. Insgesamt regen die Ergebnisse dazu an, die gewonnenen Kenntnisse auf eine biokompatible Nanokapselplattform zu übertragen, um einen gezielten immunmodulatorischen Transport zu dendritischen Zellen über ein Antikörperderivat zu validieren.
DDC: 570 Biowissenschaften
570 Life sciences
610 Medizin
610 Medical sciences
Institution: Johannes Gutenberg-Universität Mainz
Department: FB 10 Biologie
Place: Mainz
DOI: http://doi.org/10.25358/openscience-6919
URN: urn:nbn:de:hebis:77-openscience-182b8e3e-8fb9-4f55-9c37-9b3f9b99de506
Version: Original work
Publication type: Dissertation
License: CC BY
Information on rights of use: https://creativecommons.org/licenses/by/4.0/
Extent: XII, 179 Seiten (Illustrationen, Diagramme)
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